蟾皮药材质量标准研究＊

曹 蔚 李 瑛 段林瑞 刘媛媛 王 凯 王四旺

第四军医大学药学系天然药物学教研室（西安710032）

蟾皮为蟾蜍科动物中华大蟾蜍（Bufo bufo gargarizans Cantor）或黑眶蟾蜍（Bufo melanostictus Schneider）的干燥皮，最早记载于《本经逢原》，自古沿用至今。习称“蛤吧皮”、“癞蟆皮”、“蟾蜍皮”、“蛤蟆皮”等。具有清热解毒，利水消胀之效，用于痈疽、肿毒、瘰疬、肿瘤、疳积腹胀等。《本草纲目》中记载：“蟾蜍其皮为元黾，主治疸疬恶疮、破症结、肿毒、肠头挺出和一切恶肿等”；《中药大辞典》中记载：“蟾皮清热解毒、消肿止痛，软坚散结”。现代药理研究发现，蟾皮水提物具有抗肿瘤作用[1]，脂溶性组分具有抑制心肌细胞膜ATP酶等作用[2]。临床用于慢性气管炎、恶性肿瘤及痈疽疮疡等治疗。近年来有关蟾皮制剂质量标准的研究报道较多，但《中国药典》尚未收载蟾皮；蟾皮药材的水分、总灰分、酸不溶性灰分等常规项目的测定，活性成分的定性鉴别也未见报道。这些项目的含量与药物的临床疗效、稳定性和安全性有密切关系。本研究对蟾皮的水分、总灰分、酸不溶性灰分等检测项目及活性成分的定性鉴别、定量测定进行较为全面的研究，为建立和完善蟾皮的质量标准提供科学的参考。

1 材料

1.1 药材 3批蟾皮药材采集自陕西省内不同地区（汉中市、西安周至县和蓝田县），2批购于河北安国、安徽亳州药市，经本教研室鉴定为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor的干燥皮。

1.2 仪器 LC－2010AHT高效液相色谱仪（日本岛津公司）；GZX－DH型电热恒温干燥箱（上海市跃进医疗器械一厂）；BL310型电子分析天平（德国Sartorius公司）；SX－4－10型箱式电阻炉控制箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；SHZ－D（III）型循环水真空泵（天津华鑫仪器有限公司）；SK250LHC超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；电子恒温水浴锅（北京化玻医疗器械有限公司）。

1.3 试剂 华蟾酥毒基对照品（中国药品生物制品鉴定所，批号：200605）；酯蟾毒配基对照品（中国药品生物制品鉴定所，批号：200507）；乙腈为色谱纯；其他试剂均为国产分析纯。

2 方法与结果

2.1 理化鉴别 取本品粉末0.1g，加甲醇5 mL，浸泡1h，滤过，滤液加对二甲氨基苯甲醛固体少量，滴加硫酸数滴，即显蓝紫色。

取本品粉末0.1g，加三氯甲烷5mL，浸泡1h，滤过，滤液蒸干，残渣加醋酐少量使溶解，滴加硫酸，初显蓝紫色，渐变蓝绿色。

2.2 薄层鉴别 取本品粉末0.5g，加乙醇10 mL，加热回流30min，滤过，滤液置10mL量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀，作为供试品溶液。另取华蟾酥毒基对照品加乙醇分别制成每1mL含0.5mg的溶液，取酯蟾毒配基对照品加乙醇分别制成每1mL含0.2mg的溶液，作为对照品溶液。用薄层色谱（TLC）法试验，吸取上述四种溶液各10μL，分别点于同一以羧甲基纤维素钠为黏合剂的硅胶G薄层板上，以环己烷－三氯甲烷－丙酮（4︰3︰3）为展开剂，展开，取出，晾干，紫外下检测，如图1。再喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同的一个绿色及一个红色斑点。

图1 蟾皮的TLC

2.3 水分及灰分测定

2.3.1 水分 按照《中国药典》（2010年版）一部附录IX H第一法进行测量[3]。称取蟾皮粉末（过2号筛）约2g，平铺于干燥至恒重的扁形称量瓶中，打开瓶盖在100～105℃干燥5h，将瓶盖盖好，移置干燥器中，冷却30min，精密称定，再在上述温度干燥1h，冷却，称重，至两次称重的差异不超过5mg为止。根据减失的重量，计算供试品中含水量（%）。结果见表1。5批蟾皮药材中水分含量平均值为10.99%。

2.3.2 总灰分 按照《中国药典》（2010年版）一部附录IX K第一法进行测量[1]。分别称取蟾皮粉末约3g，置灼烧至恒重的坩埚中，放入电阻炉中，缓缓灼烧，根据残渣的重量，计算供试样品中总灰分的含量，结果见表1。5个蟾皮样品中总灰分量平均值为13.21%。

2.3.3 酸不溶性灰分 供试品先按2.3.2的方法步骤测定其总灰分，然后取所得的灰分，在坩埚中加入10mL稀盐酸，水浴加热10min，用50℃左右的热水5mL将表面皿冲洗，冲洗液并入坩埚中，用无灰滤纸过滤，用热水冲洗，残渣连同滤纸一同放入坩埚中，干燥，放入电阻炉中，缓缓灼烧，直到温度升至550℃，再灼烧8h，关闭电阻炉，过夜，取出坩埚，放置干燥器中30min，根据残渣的重量，计算供试样品中灰分的含量，结果见表1。5个测试样品中酸不溶性灰分含量平均值为4.58%。

表1 蟾皮水分、总灰分、酸不溶灰分测定结果（n＝3）

2.4 华蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量测定

2.4.1 色谱条件 色谱柱：Kromasil C18（250 mm4.6mm，5μm）；流动相：乙腈－0.5%磷酸二氢钾溶液（50∶50，用磷酸调PH 3.2）；检测波长：296nm；流速：1.0mL·min－1；柱温：40℃；进样量：20μL。理论塔板数按华蟾酥毒基峰、脂蟾毒配基峰计算应分别不低于4000。色谱见图2。

图2 蟾皮的HPLC

2.4.2 供试品溶液的制备 分别取蟾皮药材，粉碎使其过2号筛。取细粉约500mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20mL，称定重量，加热回流1h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4.3 标准曲线 取0.355mg·mL－1的华蟾酥毒基对照品溶液和0.215mg·mL－1的脂蟾毒配基对照品溶液，等体积混合，并梯度稀释两倍，制成华蟾酥毒基浓度为177.50、88.75、44.38、22.19、11.09、5.55、2.77μg·mL－1，脂蟾毒配基浓度为107.50、53.75、26.88、13.44、6.72、3.36、1.68μg·mL－1的混合标准品溶液。分别精密吸取20μL注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定。以浓度（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标绘制标准曲线，得华蟾酥毒基的回归方程为：Y ＝17 478X＋14 095（r＝0.999 9），脂蟾毒配基的回归方程为：Y＝18 863X＋9 439.9（r＝0.999 9）。结果表明，华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的浓度分别在2.77～177.50、1.68～107.50μg·mL－1范围内与各自峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.4.4 精密度试验 取蟾皮样品连续进样5次，测定峰面积。结果，华蟾酥毒基、脂蟾毒配基峰面积的RSD分别为0.31%、0.30%。表明仪器精密度良好。

2.4.5 重复性试验 取同一产地蟾皮样品按2.4.2项下操作方法制备5份样品溶液，进样测定。结果，华蟾酥毒基、脂蟾毒配基峰面积的RSD分别为0.31%、1.01%。表明本实验所用的方法重复性良好。

2.4.6 稳定性试验 取同一产地蟾皮样品按2.4.2项下操作方法制备样品溶液，分别于0、1、2、4、8、12h测定峰面积，结果，供试品溶液中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基峰面积的RSD分别为0.65%、0.87%。表明华蟾酥毒基、脂蟾毒配基在12h内稳定。

2.4.7 加样回收率 精密称取已知含量的蟾皮样品9份，精密加入不同量的对照品，按照2.4.2项下的方法制备供试品溶液，进样测定，计算加样回收率，结果见表2。平均回收率为98.80%，RSD为2.81%。

表2 加样回收率实验结果

2.4.8 样品含量测定 按上述色谱条件测定5批蟾皮中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量，见表3。

表3 蟾皮药材中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量

3 讨 论 蟾酥（Venenum bufonis）为蟾蜍耳后腺及皮肤腺的干燥分泌物，蟾皮为蟾蜍去除内脏后的干燥表皮。蟾酥、蟾皮及其制剂均在临床广泛应用，但化学成分及功能主治却不尽相同。蟾酥的质量标准收载于《中国药典》，但尚未收载蟾皮。蟾皮收载于《江西省地方药材标准》及《江苏省地方药材标准》，但其质量标准相对简单。故本研究参照《中国药典》（2010年版）蟾酥的质量标准，对蟾皮药材质量标准进行了进一步的补充研究，为本品炮制及含制剂的生产与研发提供参考。

根据《中国药典》（2010版）一部中蟾酥药材水分含量测定的方法，考虑到目前未有蟾皮中含有挥发油的文献报道，而《中国药典》水分含量测定第一法（烘干法）测定水分方法简单，操作易行，因此本文采用此法对蟾皮的水分进行测定。

在本品的理化鉴别试验中，参照文献[4]对含有2’6－去氧糖组成的强心苷类成分进行显色反应，反应迅速、颜色明显。此外，笔者还将供试溶液点于滤纸片上，干燥后，喷对二甲氨基苯甲醛试剂（1g对二甲氨基苯甲醛溶于l00mL乙醇中，再加25mL盐酸混合而成），于90℃加热半分钟可显灰红色斑点，因重现性差，故不推荐列入质量标准。

蟾皮中富含蟾毒配基类化合物。其中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量相对较高。故在我们的研究中选择以华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量做为蟾皮的检测指标，参考《中国药典》（2010年版一部）蟾酥项下方法进行鉴别，以期达到控制蟾皮质量的目的。但由于大多供试品中酯蟾毒配基未检出。结合含量测定结果，考虑到蟾皮中华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的含量远低于蟾酥的实际，故不推荐华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的薄层鉴定列入质量标准。

[1]孙凌飞，申文江.蟾皮提取液对肾癌细胞凋亡及Fas、FasL和bcl－2表达的影响[J].中国医药导刊，2000，2（5）：32－33.

[2]陈才法，李景辉，郑维发，等.蟾酥、蟾皮、蟾衣提取物对心肌细胞膜 ATP酶的影响[J].四川动物，2008，27（3）：393－395.

[3]国家药典委员会.中国药典（一部）[S].北京：化学工业出版社，2010：附录52.

[4]国家药典委员会.中国药典（一部）[S].北京：化学工业出版社，2010：360.7