精神分裂症大鼠血浆 H2S、Hcy、叶酸及 VitB6水平及其相关性分析

张国富 任彩丽 祁曙光 张云彪 陆志新 吕振雷

硫化氢(H2S)是蛋氨酸代谢的终产物,在 Hcy代谢过程中,可由 CBS催化半胱氨酸生成,CBS同时是 H2S生成的关键酶。越来越多的研究证实 H2S在神经系统中有重要的生理作用。由此推测,H2S作为 Hcy代谢的终产物,可能参与了高同型半胱氨酸血症致精神分裂症的发病机制。同型半胱氨酸(Hcy)来源于饮食中摄取的必需氨基酸蛋氨酸,是蛋氨酸循环的中间代谢产物之一,参与体内去甲肾上腺素 (NE)、DN A、蛋白质等重要物质的甲基化反应。研究发现,精神分裂症患者存在 Hcy水平异常升高[1-2]。后者是由于机体内 Hcy代谢相关酶胱硫醚-β-合酶(CBS)和 /或 5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(M THFR)基因突变或辅助因子叶酸、维生素(Vit)B12及维生素(Vit)B6缺乏所导致。但 Hcy致精神分裂症的确切机制仍不十分清楚。为探讨这一机制本研究对精神分裂症大鼠模型的血浆 H2S、Hcy以及叶酸、VitB6水平进行检测,并分析其相关性。苯环已哌啶(PCP)是广泛应用于制作精神分裂症动物模型的药物[3],对研究精神分裂症的发病及治疗有较高的价值,国内对 PCP所致精神分裂症模型很少报道。

1 对象与方法

1.1 对象 实验动物:实验动物选用成年雄性 Spraqui-Dawlay大鼠 16只 ,体重 280～320g,笼养 ,每笼 4只 ,置于室温 25℃,自然昼夜循环非直接光照条件下生活,自由进食、饮水。实验动物由南京医科大学动物中心提供。药物:Phencyclidine(PCP)由美国 Sigma公司提供,溶于 0.9%的生理盐水。

1.2 方法

1.2.1 精神分裂症动物模型的建立 参照 Sams-Dodd制作精神分裂症动物模型的方法[4],PCP组每日腹腔注射(i.p)PCP7.1/umol/kg(2.0mg/kg),连续注射 3天。正常对照组给予等体积生理盐水。各组均于末次注射后观察每只大鼠的刻板行为和社会行为,刻板行为每 10分钟评分 1次,观察 60分钟,取其平均值。刻板行为评分标准和社会行为观察参考Sams-Dodd的刻板行为评分标准:0分 ,静止不动 ,几乎或根本没有活动;1分,正常活动,偶尔有向前的运动;2分,活动伴随反复的向前探索(大鼠以刻板行为沿笼子周边转圈,且无其他行为 );3分,连续地向前探索;4分,重复地抬头、摇头或旋转;5分,快速地摇头、转圈或头的背腹运动(通常大鼠静止不动)。社会行为是指大鼠对新环境的探索行为,包括不停地嗅探、环绕新区域运动、有规律地抬起前肢向四周探望和接触周围陌生大鼠等社会行为,PCP组大鼠的社会行为和探索行为明显减少,常不停地以某种刻板形式沿着笼子的周边运动,且避开或忽视与别的不熟悉的大鼠接触,同时有规律的抬头行为明显减少。刻板行为评分:正常组 1分 ,PCP组 2～3分,符合模型标准。

1.2.2 血浆 Hcy、叶酸及维生素 B6水平测定 精神分裂症组早晨用真空采血管采空腹血 5 ml(肝素抗凝),3000 r/min离心,取出血浆放入-80℃冰箱内储存。血清 Hcy水平采用酶联免疫法测定,由美国雅培公司产 IMX全自动免疫分析仪及其配套试剂进行检测,正常值范围 5～15 μmol/L。血清叶酸、VitB6水平应用化学发光法测定,用化学发光仪(ACS180SE,德国贝尔公司)及其配套试剂进行检测。

1.2.3 血浆 H2S水平测定 采用去蛋白方法,在试管中加入 1%醋酸锌 0.25ml,然后加入 0.1ml血浆,使血浆中的硫离子与醋酸锌充分结合形成醋酸锌胶体,再加入 20 mmol/L对苯二胺盐酸盐 7.2 mmol/L HCl 250μl和 30 mmol/L三氯化铁 1.2 mmol/L HCl 250μl,室温孵育 20 min,使之充分显色,加入 10%三氯醋酸 0.5 ml,使蛋白沉淀,离心(6000r/min),5 min,吸取上清液,用全自动酶标仪 (Bio- Tek Elx800,美国)在波长 665 nm处检测吸光度,根据 NaHS标准曲线计算血浆中 H2S的含量 ,结果以μmol/L表示。

1.3 统计处理 所有数据采用t检验及直线相关分析,应用SPSS12.0软件进行统计学处理。

2 结 果

2.1 精神分裂症组和正常对照组血浆 H2S及 Hcy、叶酸、VitB6水平和 Hhcy检出率的比较 精神分裂症组、对照组血浆 Hcy水平分别为 10.5～ 38.6 μmol/L和 4.9～ 17.5μmol/L,两组间差异具有统计学意义(P＜0.001),见表1。将血浆中Hcy＞ 15 μmol/L确定为 Hcy。精神分裂症组 Hcy的占 45.5%,对照组仅占 10%,明显高于对照组,差异具有显著性(i2=15.66,P＜0.001)。

表1 精神分裂症组和正常对照组血浆 H2S、Hcy、叶酸、VitB6的水平 (n=8,±s)

表1 精神分裂症组和正常对照组血浆 H2S、Hcy、叶酸、VitB6的水平 (n=8,±s)

注:与正常对照组比较*P＜0.05,**P＜0.01,***P＜0.001 2.2 精神分裂症组血浆 H2S水平与 Hcy、叶酸、VitB6水平的关系 直线相关分析显示,血浆 H2S水平与 Hcy水平呈负相关 (r=-0.7214,P＜0.001),与血浆叶酸及 VitB6水平呈正相关(r=0.5189,P ＜0.001;r=0.4299,P ＜0.05)。

组 别 H2S(μ mol/L)Hcy(μ mol/L)叶酸(μ g/L)VitB6(μ g/L)研究组 33.89± 7.72** 21.39± 8.21*** 4.57± 2.15** 12.25± 5.56*对照组 56.17± 11.64 10.05± 3.29 7.70± 2.18 23.17± 6.61

3 讨 论

PCP作为一类精神活性物质,具有与苯丙胺(AM P)类所致精神障碍不同,既有幻觉妄想等阳性症状,又有情感淡漠、意欲减退等阴性症状。它不仅能在正常人身上诱发注意缺陷,运动功能失调、本体感觉障碍、象征性思维,也能使精神分裂症患者原有的精神症状恶化[5]。

内源性 H2S是由 Hcy代谢产物之一半胱氨酸在 CBS、CSE或半胱氨酸转移酶的催化下产生的,脑内产生 H2S的主要酶是 CBS。在 Hcy的代谢过程中,当机体蛋氨酸充足时,Hcy通过转硫化途径合成胱硫醚,后者在 CSE作用下被代谢为半胱氨酸、α-酮丁酸和 H2S等[6]。另外,不同于大多数文献的报道,Chen等[7]研究发现 CBS催化生成 H2S的主要机制不是通过半胱氨酸水解产生,而是通过半胱氨酸和同型半胱氨酸的置换反应实现的,这个途径产生 H2S的量至少是通过半胱氨酸水解产生的 H2S的 50倍。以上观点虽还有待进一步的研究证实,但都提示 H2S和 Hcy可能存在着内源性的相互调节作用。

本研究结果表明,精神分裂症大鼠血浆 H2S的水平显著低于正常对照组,而血浆 Hcy水平明显高于正常对照组(P＜0.01,P＜0.001)。内源性 H2S是半胱氨酸的代谢产物,而Hcy被认为是精神分裂症的一个危险因素,它们都与 CBS表达及活性相关。由此推测,精神分裂症大鼠血浆中 Hcy水平增高及 H2S水平降低,均可能由于 CBS酶活性的改变或缺乏。精神分裂症大鼠血浆中 H2S水平降低有什么意义呢?现有基础研究表明,生理浓度的 H2S可易化海马长时程增强,参与学习和记忆机制[8];具有抗氧化损伤的作用,能保护神经元免受兴奋性氨基酸(谷氨酸)、过氧化亚硝基和次氯酸导致的氧化应激[9-12]。

目前研究非常明确的是,Hhcy多是由于缺乏 Hcy代谢过程中的辅助因子叶酸及 VitB6所引起的,并且通过补充叶酸、VitB12及VitB6可以降低血浆 Hcy浓度。本研究同样也发现精神分裂症大鼠血浆叶酸及 VitB6水平明显低于正常对照组,与当前国内外的研究结果相符[13]。VitB6参与 Hcy代谢的转硫途径 ,Hcy在 CBS作用下,以 VitB6为辅酶 ,与丝氨酸缩合为胱硫醚,最终裂解为α-酮丁酸、半胱氨酸,后者再由CBS或 CSE催化生成 H2S。本研究结果表明,血浆 H2S水平与血浆叶酸及 VitB6水平呈正相关(r=0.5341,P＜0.01;r=0.4615,P＜0.05);故缺乏 VitB6时,体内 H2S水平也会降低。因此,推测通过补充 VitB6可提高血浆 H2S水平,从而降低精神分裂症的患病危险。此推论需要临床观察研究证实。

本研究检测血浆中 H2S水平,由于取材局限不能直接检测脑组织中 H2S水平,虽然 H2S在外周和中枢的代谢途径存在区别,但是 H2S是脂溶性气体小分子物质,可快速通过血脑屏障和血管内皮细胞,因此血浆中 H2S水平在一定程度上反映了脑组织中 H2S的水平。由于研究方法和样本量的不同所导致的相关研究中报道的血浆中 H2S和 Hcy值的差别。

H2S是新近发现的新型气体信号分子,在神经系统、心血管系统等均发挥重要的生理作用,本研究发现精神分裂症大鼠血浆中 H2S含量降低,低水平的 H2S是否是精神分裂症的危险因素,非常值得进一步的研究探讨。

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