重组人促红细胞生成素对急性脑缺血大鼠脑梗死体积及Nrf2、HO－1表达的影响1）

郭军红，孟华星，严 澎

氧化应激在急性缺血性脑损伤中发挥了重要的作用［1］。近年来有大量研究证实，重组人促红细胞生成素（rhEPO）在缺血性脑损伤中发挥了抗氧化作用［2］，但其作用机制仍不清楚。本研究采用大鼠永久性局灶性脑缺血（pMCAO）模型，通过对缺血脑组织中脑梗死体积、核因子E2相关性因子2（Nrf2）及血红素加氧酶（HO－1）表达的研究，探讨rhEPO在缺血性脑损伤的抗氧化作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 36只健康雄性SD大鼠（山西医科大学实验动物中心提供），体重230g～270g。

1.2 药品及试剂 重组人促红素注射液（北京四环生物制药有限公司），Nrf2、HO－1兔抗鼠多克隆抗体（北京博奥森生物技术有限公司，免疫组化用），PV－6001二步法免疫组化检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），辣根过氧化物酶标记的二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.3 分组 随机将36只SD大鼠分为假手术组（n＝12）、缺血组（n＝12）和rhEPO治疗组（n＝12）。每组随机选取6只行免疫组化。

1.4 模型制作与取材

1.4.1 模型制作 采用改良的Zea－Longa法［3］制备pMCAO模型。大鼠在术前24h禁食，术前4h禁水，10%的水合氯醛（0.35mL／kg）腹腔注射麻醉后，仰卧位，取颈正中切口，暴露并钝性分离左侧颈总动脉（CCA）、颈外动脉（ECA）、颈内动脉（ICA）。结扎ECA远端、CCA近心端，用动脉夹夹住ICA，在CCA近分叉处约5mm处剪一“V”型小口，将预先准备好的直径约0.26mm的蘸有石蜡的尼龙线头轻轻插入CCA，从CCA分叉处计算，插入18mm～20mm时稍遇阻力即可停止，并结扎CCA，逐层缝合筋膜、皮肤，建立pMCAO模型。假手术组除插入鱼线约10mm外，其余操作与缺血组相同。rhEPO治疗组在缺血2h时腹腔注射rhEPO 5 000IU／kg，假手术组与缺血组则给予等量的生理盐水。参考Zea Longa评分标准，评分为0分和4分者均剔除。缺血24h后处死大鼠。

1.4.2 取材 造模完成后，各组随机取6只在相应时间点心脏灌注去血后，断头取脑，经10%中性甲醛固定24h后，取视交叉后1mm～4mm脑组织，石蜡包埋，切片行免疫组化。

1.5 脑梗死体积的测量 大鼠在缺血24h后以10%水合氯醛麻醉后断头取脑，以生理盐水冲洗后，将脑组织迅速置于－20℃冰箱冻存20min后取出，去除嗅球、小脑和低位脑干，切除额极和枕极，以2mm间距行冠状位切片，共5片，然后浸于2%的TTC（2，3，5－氯化三苯基四氮唑）磷酸盐缓冲液中，置于37℃的水浴箱中染色30min，再在4%的多聚甲醛溶液中固定12h，取出后用数码相机照相，最后利用图像分析软件计算出梗死区域的面积，为了消除脑水肿的影响，梗死区域体积用占对侧大脑半球体积的百分比来表示。

1.6 免疫组化检测Nrf2及其HO－1的表达 免疫组化方法严格按说明书染色步骤进行，抗原修复后，孵育一抗，Nrf2和HO－1兔抗鼠多克隆抗体分别按1∶100和1∶200稀释。每片在高倍镜（400倍）下随机选取损伤侧（左侧）皮层范围内5个非重叠视野，利用Image－Pro Plus软件计算平均阳性细胞数。1.7 统计学处理 采用SPSS11.5统计软件包进行分析，数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析和Student－Newman－Keuls（SNK－q）检验。

2 结 果

2.1 各组大鼠脑梗死体积比较 TTC染色结果：脑组织梗死灶呈白色，正常组织呈红色，部分组织表现为由白色向红色过渡区。缺血组左侧半球梗死灶主要位于额顶叶皮质及纹状体。假手术组无梗死体积。与缺血组相比，rhEPO治疗组脑梗死体积明显减小，有统计学意义（P＜0.01）。详见表1。

表1 各组大鼠脑梗死体积比较（x±s）

2.2 免疫组化测定脑组织中Nrf2及HO－1的分布与表达 假手术组可见HO－1在细胞浆中有少量表达；缺血组阳性细胞增多，阳性细胞主要为缺血区的神经元和星形胶质细胞。与假手术组相比，差异有统计学意义（P＜0.01）；rhEPO治疗组阳性细胞增多更为明显，与缺血组比较差异有统计学意义（P＜0.01）。

假手术组中有少量Nrf2浆阳性细胞，无明显核阳性细胞。缺血组可见明显的Nrf2核阳性细胞，核阳性细胞主要为缺血区的神经元和星形胶质细胞。与假手术组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）；rhEPO治疗组可见大量的核阳性细胞，与缺血组比较，差异有统计学意义（P＜0.01）。表明rhEPO能增加核内Nrf2的含量。详见表2。

表2 各组大鼠Nrf2、HO－1阳性细胞数比较（x±s）

3 讨 论

Nrf2是新近发现的一种对氧化应激非常敏感的基因转录因子，Nrf2的缺失或激活障碍，会使细胞对氧化应激的敏感性提高［4］。卒中发生前Nrf2的激活能够清除缺血半暗带区的自由基。HO－1是一种重要的抗氧化酶，又称热休克蛋白32（HSP32），在各种理化因素如发热、氧化应激等状态下，可在脑中大量被诱导、表达，从而发挥作用。rhEPO在缺血性脑损伤中具有抗氧化作用，但其抗氧化作用机制是否与Keap1－Nrf2／ARE抗氧化系统有关，尚不清楚。

本研究通过观察大鼠局灶性脑缺血模型Nrf2及HO－1的表达，进一步探讨rhEPO的抗氧化作用机制。免疫组化结果证实，假手术组有少量的Nrf2和HO－1阳性细胞；缺血组Nrf2核阳性细胞和HO－1阳性细胞增多，提示急性脑缺血发生后，Nrf2与Keap1分离，转位进入胞核，进而与核内的ARE结合，上调HO－1；rhEPO治疗组与缺血组相比，Nrf2核阳性细胞和HO－1阳性细胞明显增多，提示rhEPO可能促进了Nrf2的核转位。本研究表明，脑缺血发生后，脑中Keap1－Nrf2／ARE抗氧化系统被激活，rhEPO可能通过激活该抗氧化系统来发挥抗氧化作用。

假手术组中有少量的阳性细胞，表明机体在生理状态下，有少量的Nrf2和HO－1蛋白的表达，并处于转录翻译与降解的平衡状态，这样就维持了生理条件下机体内的氧化／抗氧化系统的平衡。由于本研究只局限在蛋白水平，rhEPO对Nrf2、HO－1核酸水平的影响以及调控机制尚不明确。

有研究表明，PI3K［5］、PKC／络氨酸［6］、MAPK［7］等细胞内信号传导途径在该抗氧化系统的激活机制中起了非常重要的作用。但有关rhEPO对该系统的激活机制的研究甚少，Hwang等［8］研究表明HO－1的上调是通过激活PI3K和ERK激酶而实现的。Gene等［2］的研究认为，rhEPO通过PI3K、MAPK途径，促进Nrf2的核转位，从而上调HO－1的表达。对于rhEPO激活该氧化系统的具体机制有待进一步研究。

rhEPO能在急性脑缺血大鼠模型中发挥神经保护作用，其机制可能与上调缺血半暗带中Nrf2和HO－1的表达，参与Keap1－Nrf2／ARE抗氧化系统有关。

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