急性冠脉综合征患者外周血单个核细胞miR－146a表达及其与炎症因子的相关性研究

郭 敏，闫 蕊，吕吉元，范春雨

目前多数学者认为动脉粥样硬化（AS）是在大、中动脉血管壁内皮细胞损伤后细胞免疫所接到的慢性炎症反应［1］。随着对动脉粥样硬化发病机制及危险因素的深入了解和积极控制，慢性心血管病的一级预防取得了令人鼓舞的进展，然而急性心血管事件（包括心脏性猝死和急性冠状动脉综合征）的预防及治疗仍缺乏有效的措施。近年研究发现，导致急性心血管病事件的主要原因是AS斑块的易损性，而炎症在易损斑块发生机制中的核心作用日益受到重视［2］。

MicroRNA是一组最近发现的内源性的非蛋白编码调控RNA，这些含有19个～23个核苷酸单链RNA可以通过与靶基因mRNA的3’UTRs不同程度的互补结合，以降解靶基因mRNA或抑制翻译两种方式调节生物体内基因的表达［3］。晚近研究提示，MicroRNA（miR－146a）在T细胞、B细胞、单核细胞中均有表达，并与多种炎症因子及转录因子的活性有密切关系，在免疫反应中miR－146a可能发挥了精细的调控作用［4］。本研究通过对急性冠脉综合征患者外周血单个核细胞内miR－146a表达水平的检测及其与炎症因子相互关系的探讨，为miR－146a在ACS中的基础研究奠定基础。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2011年7月—2012年2月在我院住院及门诊随访的患者91例，其中急性心肌梗死（AMI）26例，不稳定型心绞痛（UA）25例，稳定型心绞痛（SA）22例，胸痛综合征（CPS）18例，所有患者均行冠状动脉造影检查。CPS组为胸痛但不伴有心电图改变和冠状动脉狭窄及痉挛［5］。

排除标准：合并严重的肝肾功能不全；心脏或其他部位的急、慢性炎症；合并脑卒中；恶性肿瘤；风湿性疾病；高热以及应用炎症抑制药物如非甾体类抗炎药、类固醇及鸦片类药物等。

1.2 研究方法

1.2.1 血样采集 AMI与UA患者均在发病24h内从前臂周围静脉采取空腹血标本，SA组和CPS组于冠状动脉造影时采血3mL，肝素钠抗凝。

1.2.2 Real－time PCR法检测 miR－146amRNA的表达 淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞（PBMC），用 miReasy Mini Kit试剂盒提取＜200bp RNA，每组设10μL RT反应体系采用miScript Reverse Transcription Kit试剂盒进行逆转录反应，取5μL cDNA模板采用the miScript Primer Assay及the miScript SYBR Green PCR Kit试剂盒进行PCR。miR－146a扩增应用 miScript通用引物及其特异性引物（5′－UGAGAACUGAAUUCCAUGGGUU－3′the miScript Primer Assay），同时以5S作为内参（上述试剂盒均购自QIAGEN公司，所用操作步骤均按照说明书进行），应用ABI7500实时定量PCR仪测定其相对表达量。

1.2.3 Northern blot法验证miR－146amRNA表达 分别提取各组细胞总RNA各100μg，用8M尿素变性的15%聚丙烯酰胺凝胶分离，并用半干式转移系统转移至尼龙膜，紫外交联固定。预杂交后，加入地高辛标记的探针，42℃杂交24h。经洗膜、曝光与放射自显影后观察，所用的寡核苷酸探针为miR－146a：U6：5′－CTCGCTTCGGCAGCAGCACA－3′。

1.2.4 ELISA法检测培养基上清炎症因子的表达 分离的PBMCs用含10%小牛血清的RPMI1640调整细胞浓度为2×106／mL，加入植物血凝素（PHA）5ng／mL浓度，置于37℃，5%CO2培养箱培养48h后，收集上清储存于－20℃用于细胞因子：肿瘤坏死因子（TNF－α）、γ干扰素（IFN－γ）、白介素－10（IL－10）检测。

1.3 统计学处理 所有资料均以均数±标准差（x±s）表示，应用SPSS13.0软件进行统计学分析，行方差齐性检验，多个均数比较用单因素方差分析，两个均数比较用t检验。P＜0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组临床资料比较（见表1） 4组患者的年龄、血脂均无统计学意义（P＞0.05）。

表1 4组患者年龄、血脂比较（x±s）

2.2 Real－time PCR和Northern blot检测 miR－146amRNA结果（见表2）

表2 各组miR－146amRNA检测结果（x±s） %

2.3 PBMCs培养基上清中细胞因子检测结果 与SA组及CPS组相比，AMI及UA组TNF－α、IFN－γ表达明显升高（P＜0.01），IL－10则无显著变化（P＞0.05）。SA组及CPS组间和AMI及UA组间各个细胞因子间差异均无统计学意义（P＞0.05）。详见表3。

表3 PBMCs培养基上清中细胞因子检测结果（x±s）ng／mL

2.4 miR－146a与炎症因子的相关性 miR－146a与TNF－α（r＝0.612，P＜0.01）、IFN－γ（r＝0.573，P＜0.01）呈显著正相关，而与IL－10无显著相关性（r＝0.166，P＞0.05）。

3 讨 论

ACS是不稳定冠状动脉粥样斑块发生破裂继发完全或不完全闭塞性血栓形成、血管痉挛而引起的一系列急性和亚急性心肌缺血的临床综合征。临床表现为不稳定型心绞痛和急性心肌梗死。炎症反应在ACS不稳定斑块的发生、发展及最终破裂过程中起着至关重要的作用。因此，参与ACS不稳定斑块破裂的炎症因子及其调节机制对防治急性冠脉综合征至关重要。

晚近研究发现，microRNA是一种存在于各种生物体内的具有广泛调节细胞代谢、增殖、凋亡、分化和发育的微小RNA。到目前为止，在人类基因组中已发现数百种MicroRNA，它们有可能对人类基因组中近30%的基因发挥调控作用［6］。已有研究发现，众多miRNA和靶基因之间形成复杂的功能网络，在免疫反应强度、时效性、细胞分化和功能调节等环节均可发挥精细调节作用［7］。晚近研究发现，miR－146a在银屑病皮损部位和类风湿性关节炎病变部位的滑膜细胞。巨噬细胞、T细胞及B细胞中表达均增加，提示miR－146a参与了慢性炎症的病理过程［7］。Taganov等［8］研究也发现在 LPS刺激后的单核细胞中miR－146a的表达增加，炎症因子TNF－α、IL－1β也可以通过NF－κB依赖的途径诱导miR－146a表达上调，从而提出miR－146a可能是免疫炎症反应的关键调节因子。而以往大量研究证实，动脉粥样硬化疾病，风湿性关节炎及银屑病都是Th1细胞功能亢进而导致的器官特异性自身免疫疾病，可能有类似的免疫调节机制。本研究发现miR－146a在ACS患者中的表达较之CPS及SA患者中的表达明显增高，提示miR－146a可能参与了ACS的斑块炎症反应，最终导致临床心血管事件的发生。

TNF－α和IFN－γ是具有广泛生物学特性的多肽调节因子，在介导免疫和炎症反应过程中起重要作用，二者在AS中大量表达，它们可以诱导自身表达及使其他细胞因子及黏附分子表达增加；损伤内皮细胞，刺激血管平滑肌增殖和收缩，促进AS斑块形成和斑块损伤处血管痉挛收缩；诱导巨噬细胞的凋亡等，从而促进了斑块的破裂，导致了ACS的发生。IL－10被认为是一种免疫抑制因子，可抑制单核巨噬细胞及T淋巴细胞合成炎症因子，减慢AS进程，也有研究证明IL－10在外周血中有抑制组织因子的作用，从而在AS进程中发挥抗炎、抗栓作用，起到稳定斑块，防治ACS发生的作用。本研究发现在ACS患者PBMC培养上清中促炎因子TNF－α和IFN－γ明显增高，抗炎因子IL－10变化不明显，并进一步发现miR－146a的表达与TNF－α和IFN－γ呈明显正相关，提示miR－146a可能是通过促进致炎因子的表达，促进ACS的发生发展。

综上所述，miR－146a可能在ACS的免疫反应中发挥积极的作用，从而可以成为ACS基因治疗的新靶点，将在下一步的研究中通过体外干预miR－146a表达，进一步探讨其在免疫反应中的调节机制，从而为ACS的临床防治提供一个新的靶点。

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［5］ Soejima H，Irie A，Miyamoto S，et al.Preference toward a T helper type 1response in patients with coronary spastic angina［J］.Circulation，2003，107：2196－2220.

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［7］ Sonkoly E，Wei T，Janson PC，et al.MicroRNAs：Novel regulators involved in the pathogenesis of psoriasis［J］.PLoS ONE，2007，2（7）：e610.

［8］ Taganov KD，Boldin MP，Chang KJ，et al.NF－kappaB dependent induction of microRNA miR－146，an inhibitor targeted to signaling proteins of innate immune responses［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2006，103（33）：12481－12486.