环介导等温扩增技术在小儿下呼吸道肺炎嗜衣原体感染中的应用

潘德锋 佘菊香 胡春艳

环介导等温扩增法(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种敏感、特异、方便快捷的核酸扩增技术。因其无需特殊设备，且具有PCR类似的灵敏度和特异性，目前日益受到临床重视[1]。肺炎嗜衣原体（Chlamydophila pneumoniae,Cpn）是一种能引起非典型性肺炎的严格细胞内寄生的病原体，能导致10%小儿社区获得性肺炎[2-3]。由于Cpn分离培养困难，临床误诊较多。本研究通过对比LAMP和最常用的酶联免疫吸附试验（ELISA）在检测小儿Cpn下呼吸道感染情况，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本研究所纳入的研究对象为2010年1月～2012年1月我科收治的80例下呼吸道感染患儿，其中，男性患儿42例，女性患儿38例。年龄2.5～8.5岁，平均年龄（5±0.5）岁。所有患儿均有不同程度的呼吸道感染临床症状，并排除其他肺外感染性疾病。

1.2 Cpn IgM抗体检测 入院当日空腹抽取静脉血2mL，抗凝后于1000r离心10min，取200μ L血清用于IgM抗体检测。方法按照德国EuroImmun ELISA试剂盒提供的操作进行。根据酶标仪测定的最OD值（λ=450nm）计算IgM的滴度。

1.3 LAMP实验 根据GenBank提供的Cpn基因序列设计两条外引物、两条内引物和两条环结合引物（因涉及专利问题，序列无法列出）。反应体系包括1μL上述3种引物，1.5μL 20×buffer，2.5μLMgCl2，1.25μLdNTP（10mmol/L），5μ L 5×Betaine，Bst多聚酶0.5μL，模板0.5μL，RNA酶0.5μL。反应条件为65℃ 45min，结束后用2%琼脂糖凝胶电泳，若出现LAMP特征性梯状条带者为阳性。

1.4 统计学方法 应用SPSS 13.0软件对数据进行统计学处理，计数资料组间比较采用χ2检验。检验水准：α=0.05，P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 患儿下呼吸道Cpn检出情况 80例患儿分别采用ELISA和LAMP法对Cpn IgM或DNA进行检测，从表1可以看出，ELISA法可检测出47例阳性，阳性率为58.8%，而LAMP法Cpn阳性患者为57例，阳性率为71.3%，经统计学分析，P＞0.05。

表1 ELISA与LAMP对Cpn的检出情况比较

2.2 服用抗生素对ELISA和LAMP检测Cpn的影响 80例患儿在进入我院治疗前，有49例曾有抗生素服用史，这些患儿分别经ELISA和LAMP检测，结果显示患儿当中，ELISA法检测出26例IgM阳性（53.1%），而LAMP的检出率达75.5%（37/49），经统计学分析，P＜0.05，见表2。

表2 ELISA与LAMP对已服用抗生素患儿Cpn的检出影响

3 讨论

Cpn是一类严格细胞内寄生的病原体，也是公认最难分离培养的微生物之一，除了血清学诊断，目前尚无其他灵敏、简便又易于推广的方法。直接免疫荧光检测脱落细胞中的抗原或者采用微量免疫荧光法检测血清中的抗体一向被认为是诊断Cpn感染的“金标准”。但对于婴幼儿来说，此方法实际可行性较小。

本实验通过LAMP技术建立的Cpn检测方法，它能在等温条件下高效地扩增DNA，与PCR相比，LAMP受到无关DNA的影响较小[4]。在一个周期为45min的LAMP反应体系中，Cpn只需要达到6个拷贝的浓度就可被LAMP检出。此外，由于LAMP是在等温条件下持续进行的扩增反应，因此温度变化导致的损耗较小，这决定了LAMP效率高的特性。通常情况下，LAMP可在60min内将目的基因扩增109倍以上。本研究结果显示，和目前临床常用的ELISA相比，LAMP具有较高的检出率。但本研究显示两者并无统计学意义，因此在后续研究当中还需要进一步增加样本含量加以分析。

在本研究所纳入的患儿当中，有49位患儿入院前曾服用过大环内酯类等抗生素治疗。而对于这些患者，ELISA仅检测出26例阳性，而LAMP可检测出37例，两者比较具有统计学差异。这表明ELISA法与LAMP法相比，虽然总体上对Cpn的检出率并无统计学差异，但对于已使用过抗生素的患儿来说，LAMP显示出了较好的敏感性。

综上所述，本研究采用LAMP检测小儿下呼吸道Cpn感染，由于其操作简单、模板需求量少等优点，有望成为核酸扩增的重要方法。随着LAMP技术的不断完善和改进，LAMP技术将在病原体诊断方面有更广阔的发展前景。

[1]Zhou S,Han S,Shi J,et al.Loop-mediated isothermal amplification for detection of porcine circovirus type 2[J].Virol J,2011,8：497.

[2]曾赛丽,游晓星,刘良专,等.衣原体肺炎患者支气管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6及IL-10的检测及临床意义[J].当代医学,2011,17(34)：15-16.

[3]张荔茗,张英,周细国.急性毛细支气管炎儿童非典型细菌感染分析[J].当代医学,2012,18(14)：3-4.

[4]Suwanampai T,Pattaragulvanit K,Pattanamahakul P,et al.Evaluation of loop-mediated isothermal amplification method for detecting enterotoxin A gene of Staphylococcus aureus in pork[J]. Southeast Asian J Trop Med Public Health,2011,42(6)：1489-1497.