TGF－β1对奶牛乳腺上皮细胞增殖与凋亡的影响

李 瑜，王凤龙，丁旭娜，杨 磊，丁玉林

（内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010018）

研究表明猪、山羊和牛乳腺退化期主要是通过细胞凋亡减少乳腺细胞数量[1]。乳腺内乳汁积滞是诱导退化期乳腺凋亡的主要原因，退化期的乳腺凋亡除受到内分泌激素的调节外，局部细胞因子也成为研究退化期乳腺凋亡的焦点[2－3]。猪、山羊和牛等动物在乳腺退化期可以检测到乳腺组织中β转化生长因子（transforming growth factorβ，TGF－β）3种亚型（TGF－β1、β2、β3）的 mRNA 表达上调，TGF－β过度表达，同时，还可以检测到乳腺细胞凋亡水平增加[4]。用小鼠的乳腺上皮细胞系体外建立退化模型，也发现乳腺上皮细胞出现DNA断裂、形成凋亡小体等明显的凋亡特征，同时TGF－β及其受体表达水平增加。可见，TGF－β是细胞凋亡的重要介导者[5－9]。

TGF－β1属于寡二聚体多肽生长因子家族，表达于多种细胞，如上皮细胞、内皮细胞、造血细胞、结缔组织细胞等[10－11]。TGF－β1通过与相应受体结合调控细胞的分泌、分化、增殖及凋亡等多种过程[12－14]，该因子在体内也可作为炎性因子参与炎症的发生发展过程，是目前发现的最强的促纤维化因子。研究发现，在体外TGF－β1通过阻止G1期细胞进入S期，从而对来源于上皮组织的细胞具有明显的生长抑制作用，是目前已知的惟一能下调HGF表达的细胞因子，在正常细胞、癌变细胞中都有着显著作用。迄今已发现许多与TGF－β1诱导细胞凋亡有关的信号转导通路，目前研究较多的有TGF－β1／Smad信号转导通路和 MAPK信号转导通路。TGF－β1／smad信号转导途径是TGF－β1诱导细胞生长抑制和细胞凋亡的主要途径[15－16]。在细胞凋亡过程中caspases是引起细胞形态学和生物学改变的关键执行者。而将大鼠的TGF－β基因敲除后，乳腺组织的凋亡水平较低。转染TGF－β1基因到妊娠期和哺乳期的大鼠乳腺中，与野生型大鼠相比转基因大鼠的乳蛋白合成减少，产乳量下降，分泌上皮细胞的存活能力下降。本试验以TGF－β1作用于体外培养的奶牛乳腺上皮细胞，以研究TGF－β1对奶牛乳腺上皮细胞增殖与凋亡的影响，将为进一步探讨和揭示乳腺疾病的发生机制供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

奶牛乳腺上皮细胞由内蒙古农业大学动物兽医学院病理实验室分离、培养、纯化和鉴定；TGF－β1、DMEM、胰蛋白酶、MTT为Sigma公司产品；胎牛血清为Hyclone公司产品；DMSO为Gibco公司产品；caspase－3分光光度法检测试剂盒为南京凯基公司产品；CO2培养箱为Thermo公司产品；酶标仪为Bio－tek公司产品。

1.2 方法

1.2.1 纯化奶牛乳腺上皮细胞生长曲线绘制 倒置显微镜观察第6代奶牛乳腺上皮细胞形态判断细胞生长状况。用2.5g／L的胰蛋白酶溶液消化生长状态良好的奶牛乳腺上皮细胞，以含100mL／L血清的DMEM培养液终止消化并稀释细胞密度至5×104个／mL，接种于24孔培养板每孔接种500 μL，于37℃、体积分数为5%CO2、的CO2培养箱中培养。每24h细胞计数一次，制作奶牛乳腺上皮细胞生长曲线。

1.2.2 TGF－β1 作用奶牛乳腺上皮细胞 用含100mL／L胎牛血清的DMEM培养液于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养奶牛乳腺上皮细胞，取第6代对数生长期细胞用于试验。用含2.5 g／L胰蛋白酶0.2mL／L EDTA的消化液消化细胞5min，用含100mL／L胎牛血清的DMEM培养液调节细胞密度。用于MTT法检测TGF－β1对奶牛乳腺增殖的上皮细胞调整细胞密度为1×104个／mL，用于分光光度法检测caspase－3活性和二苯胺反应法测定DNA片段化率的上皮细胞调整细胞密度为1×106个／mL。按每孔100μL接种于96孔板。培养24h细胞贴壁完全，吸弃孔内培养液，按每孔100μL加入无血清的DMEM培养液培养，培养24h吸弃孔内培养液。将细胞分为对照组、试验组。试验组用浓度为1、5、10ng／mL的 TGF－β1诱导培养细胞3、6、12、24、48h，对照组加入无血清培养液每孔100μL，每个试验组设3个重复。

1.2.3 MTT法检测TGF－β1对奶牛乳腺上皮细胞增殖的影响 诱导时间结束后，每孔加入20μL MTT溶液，轻振培养板置培养箱中继续培养4h，弃去孔内培养液，加入100μL DMSO，室温震荡10min～20min，于酶标仪上测定570nm波长的测吸光值，试验重复4次。

1.2.4 分光光度法检测caspase－3活性 诱导时间结束后，收集各组细胞。用预冷的PBS洗涤2次，2000r／min离心5min，尽量去除上清，加入细胞裂解液，冰上孵育40min，期间漩涡振荡3次～4次，每次10s，10000r／min 4℃离心1min，吸取50μL上清液，同时加入50μL 2×Reaction buffer和5μL的caspase－3substrate，于37℃光孵育4h后，置酶标测仪上测定405nm波长的吸光度值（OD），检测诱导剂组caspase－3活化程度。

1.2.5 二苯胺反应法测定DNA片段化比率 诱导时间结束后，收集各组细胞。1000r／min离心10 min，用PBS洗涤3次。沉淀物用0.5mL低渗溶解缓冲液于37℃溶破1.5h，溶破物15000r／min离心15min，上清液含有片段化DNA（以S1表示）。沉淀中加入高渗缓冲液50μL，室温静置30min后，15000r／min离心10min，上清液含有片段化DNA（以S2表示），沉淀以PP表示。合并S1和S2为S，加入等体积125mL／L三氯醋酸，15000 r／min，离心10min弃上清，收集沉淀（以SP表示）。SP和PP用125mL／L三氯醋酸洗涤3次后，分别加入100μL 125mL／L三氯醋酸，95℃加热15 min。在样品中分别加入100μL新鲜配制的40 mL／L二苯胺 溶液，95 ℃ 加热 10min，15000 r／min，离心10min，取100μL上清至96孔酶标板，于酶标仪上读取595nm吸光值。按公式：DNA片段化百分率＝SPA595／（SPA595＋PPA595）×100%计算DNA片段化百分率。

1.2.6 数据分析 各试验组设置3个重复，每个试验独立重复4次。采用SAS9.0软件进行单因素方差分析，所得数据均以均数±标准差表示，差异显著表示为P＜0.05，差异极显著表示为P＜0.01。

2 结果

2.1 奶牛乳腺上皮细胞培养结果

倒置显微镜观察纯化的乳腺上皮细胞，从形态上看奶牛乳腺上皮细胞排列紧密，呈铺路石状（图1）。不同时间消化细胞进行细胞计数并绘制生长曲线，结果显示生长曲线中细胞数量与时间成正相关状态。其中1d～3d为潜伏期、3d～7d为细胞增殖期、7d～8d为对数生长期，而7d～11d为平台期（图2）。

图1 纯化的乳腺上皮细胞形态观察（200×）Fig.1 Purified mammary epithelial cells observed with microscope（200×）

图2 纯化乳腺上皮生长曲线Fig.2 Grow curve of purified mammary epithelial cells

2.2 TGF－β1对乳腺上皮细胞增殖的影响

检测TGF－β1处理的第6代牛乳腺上皮细胞的活细胞570nm处的OD值。不同浓度TGF－β1处理细胞，波长570nm处的OD值随时间逐渐降低呈一定的正量效关系，对照组细胞570nm处的OD值随时间平缓增大。与对照组比较，1、5、10ng／mL TGF－β1各组对体外培养的乳腺上皮细胞均有抑制增殖作用（P＜0.05）（图3）。1、5、10ng／mL TGF－β1组间比较，抑制增殖作用均有统计学差异（P＜0.05）。不同浓度处理组与时间组间有交互作用（P＞0.05）。

图3 MTT法检测TGF－β1对乳腺上皮细胞增殖的影响Fig.3 Effects of TGF－β1on mammary epithelial cell proliferation detected by MTT method

2.3 TGF－β1对乳腺上皮细胞凋亡的影响

于酶标测仪上检测TGF－β1处理的第6代牛乳腺上皮细胞的活细胞，分光光度570nm处的OD值确定凋亡诱导剂组caspase－3活化程度。不同浓度TGF－β1处理组，培养的乳腺上皮细胞caspase－3的活性随TGF－β1浓度的增大而平稳的增高，呈一定的量效关系。经方差分析，与对照组比较，5 ng／mL／和10ng／mL／TGF－β1均有抑制增殖作用（P＜0.05），1ng／mL／与对照组比较不具有统计学差异（图4）。不同浓度处理组与时间组间有交互作用（P＞0.05）。从结果分析各时间处理组中caspase－3的活性在6h时达到最大值，与其他时间点比较差异均显著（P＜0.05），后逐渐降低并趋于平缓，3、12、24h时间点差异不显著（P＞0.05）。

图4 caspase－3法检测乳腺上皮细胞凋亡Fig.4 Mammary epithelial cell apoptosis detected by Caspase－3method

2.4 DNA片段化比率的检测结果

于酶标测仪上检测TGF－β1处理的第6代牛乳腺上皮细胞的活细胞酶标仪上读取分光光度595 nm OD值，按公式DNA片段化百分率＝SPA595／（SPA595＋PPA595）×100%计算DNA片段化百分率，DNA片段化比率随TGF－β1浓度升高而升高，呈量效关系。与对照组比较1、5、10ng／mL TGF－β1均有促进凋亡作用（P＜0.05），3h和6h时间之间差异不显著（P＞0.05），12、24、48h时间之间差异显著（P＜0.05）（图5）。不同浓度TGF－β1处理组和时间之间有交互作用（P＞0.05）。

图5 二苯胺反应法测定DNA片段化比率Fig.5 DNA fragments ratio detected by diphenylamine reaction

3 讨论

TGF－β1属调节细胞生长和分化的转录生长因子超家族，具有广泛的生物学活性，参与早期胚胎发育、软骨和骨的形成、胞外基质的合成、炎症、间质纤维化、免疫和内分泌功能的调节等生理或病理过程，并在肿瘤的形成和发展起重要作用。TGF－β1对正常细胞及早期肿瘤的抑制作用是通过调控细胞周期，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡来实现的。研究表明，在许多类型细胞中，TGF－β家族成员不仅能抑制细胞增殖，且能诱导细胞凋亡。在人初乳中TGF－β1浓度的高低决定了母亲的哺乳成败和哺乳持续时间的长短，可见TGF－β1还与乳腺的发育、分化及泌乳功能密切相关。细胞凋亡是细胞在一系列基因的激活、表达、调控等作用下而采取的主动死亡过程。研究乳腺细胞凋亡、凋亡发生机制的基因调控将有助于进一步探讨和揭示乳腺生物学的基本规律。TGF－β1是主要的致纤维化细胞因子，主要功能是调节细胞生长和分化，TGF－β1可能在奶牛乳腺炎发生过程中起到一定的调控作用。

细胞接种时要选择适当的细胞密度，接种量低细胞间距大，并且代谢物中包含刺激细胞分裂的物质达不到一定浓度，细胞生长较慢不易形成单层，接种量高细胞虽然很快形成单层并达到一定数量，但细胞衰退的速度也相对加快[17]。细胞传代培养多根据细胞增殖特性选择合适的细胞浓度接种。本试验绘制生长曲线检测细胞生长状态，以传代培养细胞浓度5×104个／mL接种细胞培养板。显微镜下观察正常细胞状态良好，细胞生长曲线的潜伏期、增殖期、对数生长期、平台期界限明显。结果显示细胞具有较高的增值能力。

MTT法是检测细胞增殖的常用方法，原理是根据活细胞线粒体中富含琥珀酸脱氢酶，此酶可使MTT分解产生蓝色结晶状沉积于细胞内或细胞周围，形成的含量与细胞增殖程度呈正相关[18]。MTT试验1最后OD值要控制在0.75～1.25，这样才能保证数据有线性关系，以减少试验1误差，确保试验1的准确性。以1×104个／mL接种可以产生较好的试验结果。试验组奶牛乳腺上皮经TGF－β1刺激后，与正常组比较细胞密度降低，细胞生长渐慢，MTT法检测结果显示，1、5、10ng／mL TGF－β1试验组与对照组比较，均有抑制乳腺上皮增殖的作用（P＜0.05），不同浓度处理组与时间组间有交互作用（P＞0.05），由此推断 TGF－β1能调控抑制奶牛乳腺上皮细胞增殖过程。有研究表明TGF－β1可作用于肾小管上皮细胞[19]，引起肾小管上皮细胞的凋亡和增殖能力的下降、肾小管萎缩。TGF－β1是促进瘢痕化形成的主要细胞因子，可以从多个方面促进成纤维细胞增殖，导致瘢痕形成，具有促人Tenon＇s囊成纤维细胞增殖的作用，TGFvβ1可以促进平滑肌细胞增殖[20]。

分光光度法检测caspase－3活性和二苯胺反应法测定DNA片段化率时以1×106个／mL接种培养板使收集的细胞数在105～107范围内，细胞量在此范围内可保证数据的线性关系。本研究采用caspase－3法和二苯胺反应法测定DNA片段化率的方法检测TGF－β1对奶牛乳腺上皮细胞凋亡作用。试验组奶牛乳腺上皮经TGF－β1刺激后与正常组比较促进奶牛乳腺上皮细胞DNA片段化率增加基因组DNA完整性降低。并检测到TGF－β1浓度增加细胞基因组DNA片段化率增加，本研究推断细胞内外过量的TGF－β1可能主要选择性的诱导了上皮细胞DNA发生断裂及凋亡。caspase－3法检测发现不同浓度TGF－β1试验组培养的乳腺上皮细胞caspase－3的活性随TGF－β1浓度的增大而平稳的增高，呈一定的量效关系。Caspases是凋亡的执行者说明TGF－β1可促进奶牛乳腺上皮细胞凋亡过程。与ailey等的报道相似TGF－β1作用于小鼠和猪的乳腺上皮细胞，Bax／Bcl－2比例升高并促进线粒体释放促凋亡因子AIF、细胞色素C、活性氧及Ca2＋，进而活化凋亡执行者caspases，后者降解其底物PARP，导致DNA断裂，从而引发细胞凋亡。关于TGF－β1在奶牛乳腺炎发生过程中如何起作用，以及TGF－β1在诱导乳腺上皮细胞凋亡过程中通过何种通路影响凋亡通路和调节细胞的应激反应，需要进一步研究探讨。

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