吲哚美辛预处理对大鼠脑缺血再灌注损伤后炎症反应的影响

李和平 李惠勉

(郑州大学第二附属医院，河南 郑州 450014)

脑缺血再灌注损伤的机制是一个复杂的病理级联反应过程。寻找一种抑制再灌注损伤的脑保护药已成为医学界的焦点。王岩等〔1〕认为吲哚美辛对大脑有保护作用，但是作用机制临床研究较少，本实验通过运用大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型，观察吲哚美辛预处理后对脑缺血再灌注损伤后脑组织海马区中白介素IL-1β和C反应蛋白(CRP)的影响，探讨其脑保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 健康成年雄性SD大鼠84只，体质量(300±50)g，由郑州大学实验动物中心提供;吲哚美辛片，由河南开封市永康药业有限公司提供;免疫组化试剂盒购自RD公司，国内分装。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组 将大鼠随机分为假手术组(28只)、模型组(28只)、吲哚美辛预处理组(28只)，每组于缺血后再灌注6、12、24、48 h又分为4个亚组，每组7只。

1.2.2 给药 吲哚美辛预处理组术给予吲哚美辛水溶片(5 mg/kg)混悬液灌胃，1次/d连续3 d，根据体重计算吲哚美辛用量;假手术组和模型组均给予同等剂量生理盐水灌胃。

1.2.3 模型制备 大鼠造模前禁食水8 h，称重后用10%水合氯醛(0.35 ml/100 g)腹腔注射麻醉，仰卧位固定于手术台。根据改良Longa的线栓法，制作左侧大鼠大脑中动脉局灶性脑缺血再灌注模型，其成功的标准采用Longa神经功能评分法，按神经缺损轻重分为5级:神经功能正常为0级;不能伸展右侧前肢为1级;向右侧旋转为2级;向右侧倾倒为3级;无自主活动伴意识丧失4级。0级和4级的被淘汰，1～3级的入选实验组，各亚组不成功者由替补组补充。

1.2.4 标本制备 模型成立后，将大鼠于各相应时间点麻醉后断头取脑，于4%多聚甲醛液中24 h后固定，并做组织切片，片厚约6～7μm。每组均取海马区组织切片做HE染色，并采用免疫组织化S-P法染色且进行DAB显色，对组织标本免疫组化结果进行定量测定，步骤按免疫组化试剂盒说明书进行。

1.3 统计学方法 数据用x±s表示，使用SPSS16.0统计软件计算，组间比较采用单因素方差分析

2 结果

2.1 神经功能缺损评分 假手术组神经功能均正常;模型组神经功能缺损最重，各时间点缺损评分与假手术组比较有显著性差异(P＜0.05);吲哚美辛预处理组神经功能缺失评分降低，各时间点与模型组比较有显著性差异(P＜0.05)。见表1。

2.2 脑组织病理特点 大体观察，模型组与假手术组大鼠病灶脑组织的肿胀最为明显，而吲哚美辛预处理组与模型组相比较，脑组织水肿有不同程度的减轻。HE染色后光镜观察:假手术组脑海马区神经细胞轮廓清晰，排列整齐，细胞核大且圆，着色较浅，细胞核多于细胞中央，偶可见嗜酸性核仁;模型组神经细胞轮廓模糊，排列紊乱，胞核小、着色变深，胞质分界不清;吲哚美辛预处理组神经细胞结构尚清晰，胞核与胞质尚能分清，提示吲哚美辛起到了神经保护作用。

2.3 免疫组化染色结果 IL-1β和CRP于假手术组均可见极少量阳性细胞表达，缺血再灌注6 h后两者的表达开始增高，于24 h达高峰，48 h开始下降，各时间点与假手术组比较均明显增高(P＜0.05);吲哚美辛预处理组各时间点与模型组相比，两者的表达都明显减少(P＜0.05)。见表2，表3。

表1 各组大鼠不同时间点神经功能缺失评分(x ± s，n=7)

表2 各组大鼠不同时间点CRP的表达(x ± s，n=7)

表3 各组大鼠不同时间点IL-1β的表达(x ± s，n=7)

3 讨论

近年来研究认为脑缺血再灌注损伤机制主要与炎症反应、氧自由基形成、细胞内钙超载、兴奋性氨基酸的毒性作用、一氧化氮(NO)的过多释放、细胞凋亡等因素有关〔2〕，以上因素之间又相互联系，并共同作用参与脑缺血再灌注损伤的过程，其中炎症反应是脑缺血再灌注损伤发生发展十分重要的环节。

研究表明脑缺血诱导白细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、星形胶质细胞、小胶质细胞和内皮细胞等释放炎性细胞因子如IL-1β、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-8(IL-8)，黏附因子、血小板活化因子(PAF)和一些炎症介质如前列腺素和NO等〔3〕，这些炎性因子的生成是造成缺血损伤向炎症损伤发生的基础，同时这些炎性因子可激活白细胞黏附到脑缺血区微血管内皮细胞上，造成内皮细胞的皱缩、坏死，破坏血-脑脊液屏障(BBB)，加重脑缺血再灌注区的损伤。此外，在脑缺血再灌注时，细胞因子IL-1β等又可以促进趋化因子和黏附因子的上调，促使白细胞与内皮细胞的黏附进一步加强，从而形成级联炎症反应。Vila等〔4〕研究表明IL-1β是缺血再灌注损伤后较早表达的炎症细胞因子之一，脑缺血发生后24 h内，就可以在患者的脑脊液和血清中显著升高，且与病情严重程度呈正相关。IL-1β主要存在于脑组织中，具有多方面生物学功能，在正常的脑组织中表达很少，而缺血再灌注时则明显升高。导致损伤的机制主要为:增加兴奋性氨基酸的神经毒性;增加神经细胞钙离子超负载，加速神经细胞死亡;刺激其他多种炎症因子及炎症介质的释放;诱导神经元基因的表达，促使细胞凋亡。本结果表明IL-1β在脑缺血再灌注后脑组织局部炎症反应起关键作用。

临床研究业已证明，CRP可以认为是炎症反应等引起的急性非特异性敏感标志物，CRP水平的高低与脑缺血再灌注损伤的炎症反应及预后呈正相关〔5，6〕。而 Mueller 等〔7〕研究表明CRP不仅直接参与炎症反应的过程，并且可作为评估指标来反映炎症的程度。Peps等〔8〕研究显示在急性炎症反应6～8 h内CRP迅速升高，可达到正常水平的几百倍甚至更高，并在48～72 h达到高峰，随着炎症反应的减轻，CRP也降低。本实验结果和其基本一致CRP可敏感地反映缺血再灌后的炎症反应动态变化。同时Peps等〔8〕研究认为CRP导致脑缺血再灌注损伤的机制可能为:活化自身受体;激活补体系统;诱导黏附分子、单核细胞组织因子及内皮细胞的表达;激活炎性细胞因子IL-1β等的释放。

Hartl等〔9〕认为通过干预炎症反应的发生发展过程，就能降低脑缺血再灌注脑损伤的进程。吲哚美辛为非甾体抗炎药，具有很强的抗炎作用，临床主要用来治疗关节炎，偏头痛等，其作用机制为抑制环氧合酶活性而减少前列腺素的合成，抑制炎性反应，制止炎症组织痛觉神经冲动的形成，并且抑制溶酶体酶的释放和白细胞的趋化作用等。本实验结果说明炎性反应参与了脑缺血再灌注损伤的病理过程;而预先给予吲哚美辛干预后，大鼠神经缺损评分减低，脑水肿减轻，IL-1β，CRP明显降低，提示吲哚美辛具有一定脑保护作用，其机制可能是通过抑制缺血再灌注区脑组织中炎症因子IL-1β、CRP的表达有关，为吲哚美辛治疗脑缺血再灌注损伤提供理论支持。

1 王 岩，闫丽儒，吕蔓华，等.吲哚美辛对脑梗死急性期炎症反应的影响〔J〕.中风与神经疾病杂志，2010;1227(12):1079-81.

2 夏 强，钱令波.心脑缺血再灌注损伤的机制及防治策略研究进展〔J〕.浙江大学学报:医学版，2010;39(6):551-8.

3 Huang J，Upadhyay UM，Tamargo RJ.Inflammation in stroke and focal cerebral ischemia〔J〕.Surg Neurol，2006;66(3):232-45.

4 Vila N，Castillo J，Davalos A，et al.Proinflammatory cytokines and early neurological worsening in ischemic stroke〔J〕.Stroke，2000;31(10):2325.

5 Di Nopoli M，Di Gianfilippa G，Sollecito A，et al.C-reactive protein and outcome after first ischemic stroke〔J〕.Stroke，2000;31(1):238-9.

6 Sepulveda JL，Mehta JL.C-reactive protein and cardiovascular disease:a critical appraisal〔J〕.Curr Opin Cardial，2005;20(5):408-16.

7 Mueller C，Buettner H，Hodgon JM，et al.Inflammation and a long term mortality after non-ST elevation acute coronary syndrome treated with a very invasive strategy in 1042 consecutive patients〔J〕.Circulation，2002;105:1412.

8 Peps MB，Hirschfield GM.C-reactive protein:a critical up-date〔J〕.Clin Invest，2003;111(12):1805-12.

9 Hartl R，Schurer L，Schmid-schonbein GW，et al.Experimental antileukocyte interventions in cerebral ischemia〔J〕.Cere Blood Flow Metab，1996;16(6):1108-10.