紫外线照射对果蝇凋亡相关基因reaper、grim、hid表达的影响

应琼琼 刘 婷 顾 蔚 (陕西师范大学生命科学学院，陕西 西安 710062)

紫外线照射对果蝇凋亡相关基因reaper、grim、hid表达的影响

应琼琼 刘 婷 顾 蔚 (陕西师范大学生命科学学院，陕西 西安 710062)

目的 探讨紫外线照射对果蝇凋亡相关基因reaper(rpr)，grim，hid表达的影响。方法 收集8 h内羽化果蝇，雌雄分开培养至10日龄，紫外线照射0，0.5，1，1.5，2 h。提取果蝇总RNA，运用逆转录PCR(RT-PCR)方法检测各组果蝇rpr、grim、hid基因的表达。结果 对照组果蝇rpr、grim、hid基因表达较弱，照射后rpr、grim、hid基因的表达量呈现先增后减的趋势。结论 紫外线照射可增加果蝇凋亡相关基因rpr，grim，hid的表达，可能是其诱导细胞凋亡的分子机制之一，但照射达到一定时间，基因表达减弱，可能是其引起衰老的原因。

紫外线照射;黑腹果蝇;凋亡相关基因;基因表达

紫外线照射会影响果蝇幼虫的细胞形态，并且影响细胞分裂〔1〕，会损伤果蝇基因组 DNA，从而引起更多的细胞凋亡〔2〕，显著降低果蝇寿命和繁殖力，对求爱行为也会产生不利影响〔3〕，连续照射果蝇三代，结果显示子代数量减少，羽化时间缩短，体重减轻，具有致畸和间接诱变效应〔4〕。机体通过凋亡的方式清除受损细胞，短时间的紫外线照射会引起果蝇损伤修复能力的增强〔5〕，若照射时间过久这种损伤没有及时修复，会导致基因突变，细胞癌变或死亡，从而诱发癌症〔6〕。因此，有关紫外线诱导细胞凋亡的分子机制成为此领域研究热点。辐射会引起果蝇细胞凋亡的变化，但对其规律及相关基因的表达目前没有足够的分析，因此本实验通过紫外线照射处理果蝇，从mRNA水平上来探讨其对果蝇凋亡相关基因rpr，grim，hid表达的影响。

1 材料与方法

1.1 动物 野生型黑腹果蝇Canton-S品系，培养于恒温恒湿培养箱，(25±1) ℃，相对湿度(RH)60% ～75%，12 L：12 D。

1.2 试剂与仪器 Trizol、PrimeScriptTMRT reagent Kit、Taq酶、dNTP均购自TaKaRa公司;氯仿、异丙醇、无水乙醇均为分析纯。254.7 nm紫外灯(220 V，15 W);Microfuge 22 R离心机、DU 730核酸/蛋白分析仪，BECKMAN公司;PTC-200 PCR，BIORAD公司;Tanon-1600全自动数码凝胶图像处理系统，上海天能科技有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 培养基配制 本实验果蝇采取玉米-糖-酵母(CSY)基本培养基培养〔7，8〕。

1.3.2 紫外线照射 收集基本培养基中8 h内羽化未交配的果蝇，按雌雄随机分管培养，每3天更换一次培养基，培养至10日龄后进行紫外线照射。每组雌雄果蝇各20只，放在培养皿中，表面覆盖一层有孔薄膜，置于紫外光源下15 cm处分别照射 0，0.5，1，1.5，2 h。

1.3.3 果蝇rpr，grim，hid基因表达的检测 采用Trizol常规一步法提取总RNA，测定RNA样品纯度，取总RNA 1 μg，逆转录合成cDNA。PCR引物由上海生工公司合成，以GAPDH作为内参基因。引物序列如下，rpr上游引物：5'-TGGCAGTGGCATTCTACATACC-3'，下游引物：5'-ATCCTCATTGCGATGGCTTG-3'，退火温度：64℃，扩增片段长度：296 bp。grim上游引物：5'-GTTCGTCAAAAAGCGACAAGTT-3'，下游引物：5'-TGGCCATGGCGGTATTTAAT-3'，退火温度：55℃，扩增片段长度：253 bp。hid上游引物：5'-GCAGGAAGGAAGGAAGCGGATAAG-3'，下游引物：5'-GAGGTGGTGGTGTTCGGCGATT-3'，退火温度：66 ℃，扩增片段长度：201 bp。GAPDH上游引物：5'-TGGGATACACCGATGAGG-3'，下游引物：5'-TGTGGGTGGGTAGTGTTCTT-3'，退火温度：54℃，扩增片段长度：220 bp。PCR反应体系：10×PCR Buffer 2.0 μl，Mg2+1.2 μl，Taq 酶 0.2 μl，dNTPs 0.8 μl，模板 cDNA 1.0 μl，上下游引物各 0.4 μl，加灭菌蒸馏水补充至20 μl。PCR反应程序：95℃预变性5 min;95℃变性30 s，退火30 s，72℃延伸20 s，共35个循环;最后72℃延伸5 min。取5 μl PCR产物加上样缓冲液经1.2%琼脂糖凝胶(含EB)电泳分离，凝胶成像系统观察结果并拍照。所有样本均取样3次，进行3次RT-PCR分析，要求相同结果需达到2次以上。

2 结果

2.1 RNA质量检测 用核酸∕蛋白分析仪检测总RNA，其OD260/OD280比值在1.8～2.0之间，符合后续分子生物学实验要求。琼脂糖甲醛变性凝胶电泳检测到28 S、18 S、5 S三条带，且18 S较宽较亮，28 S与5 S亮度接近，弱于18 S，RNA结构基本保持完整，DNA与蛋白质的污染极少，表明抽提到较高质量的总RNA(图1)。

2.2 内参基因GAPDH的表达 紫外线照射前后，均扩增出GAPDH基因，片段大小为220 bp，与预期相同(图2)，且在各样本中表达均一，表明该内参基因及RT-PCR体系符合半定量表达分析的要求。

2.3 果蝇rpr基因的表达 对照组果蝇rpr基因表达非常弱，照射后rpr基因表达量显著增加(图2)，雄蝇照射1.5 h表达量最高，2.0 h时表达量下调回对照组水平，雌蝇照射0.5 h表达量最高，随时间延长表达量略有下调。

2.4 果蝇grim基因的表达 对照组果蝇grim基因表达非常弱，照射后grim基因表达量显著增加(图2)，雄蝇照射1.0，1.5 h表达量最高，雌蝇照射0.5，1.0，1.5 h表达量最高，2.0 h时均下调回对照组水平。

2.5 果蝇hid基因的表达 对照组果蝇hid基因表达较弱，照射后hid基因表达量显著增加(图2)，雄蝇照射0.5 h表达量最高，1.5 h时表达量下调回对照组水平，雌蝇照射1.0 h表达量最高，2.0 h时表达量均显著下调。

图1 果蝇总RNA

图2 紫外线照射后果蝇体内GAPDH、rpr、grim、hid基因的表达

3 讨论

本文结果表明紫外线照射可以诱导rpr，grim，hid的表达，导致细胞凋亡，从而修复造成的损伤。但当照射达到一定时间，损伤程度超过了生物体修复能力，凋亡基因的表达减弱甚至低于正常水平，组织、器官的功能就逐步发生障碍，导致寿命降低，与本实验室前期所证实的γ射线照射雄蝇能显著缩短其寿命相符〔8〕。Bergmann等〔9〕研究发现，在果蝇的发育进程中，rpr和grim仅在将要死亡的细胞中表达，而hid可以在正常存活的细胞中表达，与本文结果一致。有关衰老机制的学说认为，体内某种程度的损伤不断累积，能影响细胞功能，导致细胞凋亡，最终造成衰老，实验结果显示对照组雄蝇rpr、grim、hid基因表达量高于雌蝇，间接表明雄蝇体内细胞凋亡的程度高于雌蝇，这就和雄蝇寿命普遍低于雌蝇相一致。果蝇体内hid基因对紫外线照射的耐受程度可能低于rpr和grim基因。此外，雌雄果蝇的rpr、grim、hid基因表达量达到最高时所对应的紫外线照射时间各不相同，这可能与雌雄个体内该基因对紫外线照射的敏感度不同有关，雌蝇体内rpr、grim基因对紫外线刺激的敏感度高于雄蝇，而hid基因刚好相反。由本实验可得出，紫外线照射能影响果蝇凋亡相关基因rpr、grim、hid表达，照射一定时间，基因表达减弱，进而导致生物体机能紊乱，机体逐渐趋于衰老。高强度的紫外线照射会对人皮肤产生红斑效应，导致皮肤癌〔6〕，还可损伤呼吸系统、免疫系统以及诱发白内障等诸多疾病〔10〕。因此紫外辐射对于生物体的影响效应越来越多的受到关注和重视。

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2 Luo X，Puig O，Hyun J，et al.Foxo and Fos regulate the decision between cell death and survival in response to UV irradiation〔J〕.EMBO J，2007;26(5)：380-90.

3 王哲鹏，刘瑞芳，王安如，等.紫外辐射对野生型、黑檀体和黄体果蝇寿命、繁殖力、求爱行为及生化指标的影响〔J〕.生命科学，2008;38(9)：816-24.

4 张建民.紫外线对黑尾果蝇的生物学效应〔J〕.昆虫知识，1994;31(4)：242-4.

5 Aguilar-Fuentes J，Fregosol M，Herreral M.P8/TTDA overexpression enhances UV-irradiation resistance and suppresses TFIIH mutations in a Drosophila trichothiodystrophy mode〔lJ〕.EMBO J，2006;26(5)：380-8.

6 翟兴礼，史本林.紫外线辐射对生物的影响〔J〕.农业与技术，2000;20(1)：44-5.

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9 Bergmann A，Agapite J，McCall K，et al.The Drosophila gene hid is a direct molecular target of Ras-dependent survival signaling〔J〕.Cell，1998;95：331-41.

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Effect of ultraviolet irradiation on the expressions of apoptosis related genes reaper，grim，hid in Drosophila YING Qiong-Qiong，LIU Ting，GU Wei.

College of Life Sciences，Shaanxi Normal University，Xi'an 710062，Shaanxi，China

Objective To study the effect on the expressions of apoptosis related genes reaper(rpr)，grim，hid in Drosophila melanogaster after ultraviolet irradiation.Methods The flies of Drosophila were collected within 8 hours after eclosion.After cultured on standard medium for 10 days，flies were exposed to ultraviolet for different times(0.0 ，0.5，1.0，1.5，2.0 h).Then the total RNA from flies were extracted.The expressions of genes rpr，grim，hid were detected by Reverse Transcription PCR(RT-PCR).Results In the control group，the expressions of apoptosis related genes rpr，grim，hid in Drosophila were weak.After ultraviolet irradiation，the expressions of genes rpr，grim，hid were increased at first and then decreased.Conclusions Ultraviolet irradiation can enhance the expressions of apoptosis related genes rpr，grim，hid in Drosophila，which may be one of the molecular mechanisms of apoptosis induced by ultraviolet.But after a certain time exposure，expressions are decreased，which may be the cause of aging.

Ultraviolet irradiation;Drosophila melanogaster;Apoptosis related gene;Gene expression

Q786

A

1005-9202(2012)11-2307-03;

10.3969/j.issn.1005-9202.2012.11.044

中央高校基本科研业务费专项资金(GK201002042)

顾 蔚(1963-)，男，博士，副教授，硕士生导师，主要从事发育遗传与衰老研究。

应琼琼(1988-)，女，在读硕士，主要从事发育遗传学研究。

〔2011-07-27收稿 2011-12-12修回〕

(编辑 曹梦园)