重组α2-HS糖蛋白的原核表达、纯化及免疫学活性分析*

王 鹏，任鹏飞，代丽萍，王凯娟，张建营#

1)郑州大学公共卫生学院流行病学教研室郑州 450001 2)河南省肿瘤流行病学重点实验室郑州 450052 #通讯作者，男，1962年10月生，博士，教授，研究方向:肿瘤流行病学，E-mail:jianyingzhang@hotmail.com

重组α2-HS糖蛋白的原核表达、纯化及免疫学活性分析*

王 鹏1，2)，任鹏飞1)，代丽萍1，2)，王凯娟1，2)，张建营1，2)#

1)郑州大学公共卫生学院流行病学教研室郑州 450001 2)河南省肿瘤流行病学重点实验室郑州 450052 #通讯作者，男，1962年10月生，博士，教授，研究方向:肿瘤流行病学，E-mail:jianyingzhang@hotmail.com

α2-HS糖蛋白;原核表达;蛋白纯化;抗原性

目的:原核表达并纯化具有生物学活性的重组α2-HS糖蛋白(AHSG)。方法:提取人肝癌细胞株HepG2细胞总RNA，逆转录得cDNA，PCR扩增出目的基因，与pMD18-T载体连接后，转化至大肠杆菌DH5α中，大量扩增后提取克隆质粒，连接至原核表达载体pEP-30a(+)中，转化BL21(DE3)，经IPTG诱导蛋白表达，通过镍离子亲和层析的方法纯化重组蛋白，采用SDS-PAGE电泳、免疫印迹杂交法对纯化产物进行分析鉴定。结果:成功构建了AHSG原核表达系统BL21(pET30a-AHSG)，最佳诱导条件为80 μmol/L IPTG诱导3 h;诱导表达的蛋白相对分子质量约54 600，主要以不溶性的包涵体形式存在，纯化后的重组蛋白质量浓度最高达2.3 g/L，经免疫印迹杂交鉴定有抗原性。结论:成功构建了AHSG原核表达系统，该系统可高效表达重组AHSG蛋白，该蛋白具有良好的抗原性。

α2-HS糖蛋白(alpha2-Heremans-Schmid glycoprotein，AHSG)是一种存在于人体血清中的糖蛋白。目前的研究［1-6］显示，AHSG与多种肿瘤关系密切，在肿瘤患者体内异常表达，是一种肿瘤相关抗原，有可能成为诊断肿瘤的一种血清学标志物。作者尝试应用大肠杆菌原核系统表达AHSG基因并对表达产物进行纯化，以获得大量的AHSG蛋白，为后续的AHSG作为一种血清学标志物在肿瘤早期诊断中的应用研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 凝胶回收试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司;Taq酶购自上海Promega公司; EcoRⅠ、SalⅠ、dNTP及T4 DNA连接酶购自宝生物工程(大连)有限公司;兔源AHSG多克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG均购自美国Gene Tex公司。

1.2 菌株与质粒 肝癌细胞株HepG2、克隆质粒pMD18-T和表达质粒pET-30a(+)均为该研究室保存;大肠杆菌DH5α购自大连宝生物工程公司;大肠杆菌BL21(DE3)购自天根生化科技有限公司。

1.3 AHSG基因的扩增 根据Genbank中AHSG基因的cDNA序列，设计其PCR引物如下:上游5’-CGGAATTCATGAAGTCCCTCGTCCTGCTC-3’(EcoRⅠ)，下游5’-CGGGTCGACCTAGACCTTGAAGTGT CTGAT-3’(SalⅠ)，产物大小1 104 bp。按照试剂盒说明提取HepG2总RNA，逆转录得cDNA;以cDNA为模板进行PCR，反应体系50 μL，包括10× Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，MgCl23 μL，上、下游引物各0.75 μL，Taq酶0.5 μL，模版cDNA 3.3 μL，灭菌超纯水32.7 μL。PCR循环条件:94℃预变性3 min;94℃变性30 s，70℃退火30 s，以后每个循环降1.5℃，72℃延伸30 s，共20个循环;94℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸70 s，共20个循环;最后72℃延伸10 min。取5 μL PCR扩增产物于8 g/L琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像系统采集图像进行分析。

1.4 克隆质粒AHSG-T的构建及鉴定 按照胶回收试剂盒说明回收AHSG基因的PCR产物，在T4 DNA连接酶作用下，与pMD18-T连接;连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，氨苄青霉素抗性筛选阳性克隆。对阳性克隆进行EcoRⅠ单酶切和EcoRⅠ与SalⅠ双酶切鉴定、特异PCR鉴定，以初步确定克隆质粒AHSG-T构建的正确性。然后对克隆质粒进行测序，阳性克隆采用通用引物M13测序，测序结果采用NCBI网上序列分析软件进行cDNA序列和氨基酸序列同源性分析。

1.5 重组表达质粒pET-30a-AHSG的构建及鉴定克隆质粒AHSG-T与表达载体pET-30a(+)均经EcoRⅠ和SalⅠ双酶切，凝胶回收AHSG DNA片段和pET-30a线性片段，在T4 DNA连接酶作用下连接，构建重组表达质粒pET-30a-AHSG，转化感受态细胞DH5α，酶切及特异PCR扩增鉴定。

1.6 AHSG重组蛋白的诱导表达及纯化 从转化成功的DH5α重组菌中使用质粒提取试剂盒提取重组表达质粒，转化感受态细胞BL21(DE3)，以构建原核表达系统BL21(pET-30a-AHSG)。使用不同浓度的IPTG(30、80、300、800和1 200 μmol/L)诱导BL21(pET-30a-AHSG)3 h，以未转染和转染空质粒pET-30a(+)的BL21(DE3)作为空白对照，行SDSPAGE，测定诱导产物中目的蛋白的浓度。以最佳IPTG浓度诱导 BL21(pET-30a-AHSG)不同时间(0.5、1、2、3、4和5 h)，行SDS-PAGE，测定诱导产物中目的蛋白的浓度，以确定最佳诱导时间。在优化后的诱导条件下诱导BL21(pET-30a-AHSG)，分析目的蛋白在细胞内的定位，即可溶性分析。在优化后的诱导条件下诱导4 L BL21(pET-30a-AHSG)，采用镍离子亲和层析的方法纯化带有组氨酸标签的重组蛋白，紫外分析法测定纯化蛋白的质量浓度。

1.7 AHSG重组蛋白的免疫学活性分析 取10 μL质量浓度最高管中的AHSG纯化蛋白行SDSPAGE，卸胶后使用湿转的方法转移目的蛋白到硝酸纤维素(NC)膜上，采用恒流模式，电流强度0.02 A，转膜时间110 min，转膜后丽春红染膜，判断转膜效果。将NC膜浸入封闭液中封闭2 h，与一抗(兔源AHSG多克隆抗体)室温孵育2 h，与二抗(HRP标记的羊抗兔IgG)室温孵育1 h，DAB显色。

2 结果

2.1 AHSG基因的RT-PCR扩增结果 扩增产物中高亮度的DNA片段长度为1 104 bp，与AHSG基因的cDNA长度一致，见图1。

图1 AHSG基因RT-PCR扩增结果

2.2 克隆质粒AHSG-T鉴定结果 见图2。AHSG-T的单酶切和双酶切产物均出现长度约为2 700 bp和1 104 bp的两条片段(与pMD18-T载体和AHSG基因的长度一致)，特异PCR扩增产物中存在1 104 bp片段，证实克隆质粒AHSG-T构建成功。

图2 克隆质粒AHSG-T的鉴定

同源性分析结果显示，扩增出的AHSG基因与NCBI网上GENE ID197的基因有7个核苷酸差异，同源性为99%;该基因编码367个氨基酸，与AHSG (NP_001613.2)有4个氨基酸差异，分别为第248位苏氨酸→甲硫氨酸，第256位苏氨酸→丝氨酸，第267位苏氨酸→丙氨酸，第358位酪氨酸→半胱氨酸，同源性为98.9%。

2.3 重组表达质粒pET-30a-AHSG的鉴定结果见图3。pET-30a-AHSG单、双酶切均获得2条分别与pET-30a(+)和AHSG基因长度一致的条带，特异PCR扩增得到约1 100 bp的基因片段，证明成功构建了含有AHSG基因的重组表达质粒。

图3 重组表达质粒pET-30a-AHSG的鉴定

2.4 原核表达系统BL21(pET-30a-AHSG)诱导条件优选结果

2.4.1 最佳诱导浓度 不同浓度IPTG均可诱导目的蛋白的表达，目的蛋白的表达量差异不明显，80 μmol/L IPTG诱导产物中的目的蛋白表达量稍大(图4)，故选择80 μmmol/L IPTG作为最佳诱导剂浓度。

图4 不同浓度IPTG诱导3 h后目的蛋白的表达

2.4.2 最佳诱导时间 诱导1～5 h样品均可观察到目的蛋白条带(图5)，但表达量无明显差异。选择3 h作为最佳诱导时间。

图5 80 μmol/L IPTG诱导不同时间后目的蛋白的表达

2.5 重组蛋白AHSG分析

2.5.1 AHSG重组蛋白的可溶性分析 结果见图6。可见目的蛋白在裂解上清中所占的比例很小，主要以不溶性的包涵体形式存在。

图6 重组蛋白AHSG在细胞内的定位分析

2.5.2 AHSG重组蛋白的纯化结果 SDS-PAGE结果见图7。测得的蛋白质量浓度最大达到2.3 g/L。

图7 AHSG重组蛋白的纯化结果

2.5.3 纯化蛋白的免疫学活性分析 免疫印迹杂交结果见图8。可见，重组蛋白可以与AHSG抗体发生特异性结合，证明重组蛋白具有AHSG抗原性。

图8 纯化蛋白的Western blot鉴定

3 讨论

AHSG是一种存在于健康人体血清中具有高度遗传多态性的糖蛋白，由349个氨基酸残基编码两条多肽链组成，主要由肝脏合成，后储存、富集于骨组织中。其基因染色体定位于3q27，由7个外显子组成，横跨8.2 kb基因组DNA，cDNA长度为1 104 bp，有AHSG1、AHSG2两个等位基因，在等电聚焦中展现其多态性，和PP63属于同源基因。

AHSG具有多种生物功能:①与胎儿大脑皮质的发育有关，在胎儿期脑脊液中高浓度表达［7］。②作为一个全身性的碱性磷酸钙阻止器，参与骨基质的形成和重组［8］。③作为一种天然的胰岛素酪氨酸激酶受体抑制剂，其血清水平与胰岛素抵抗水平有关。④可阻断转化生长因子和细胞表面受体的结合，抑制转化生长因子的信号转导，并可阻止TGF-β诱导的上皮间质细胞的转换，在肿瘤进程中发挥作用。⑤在一些血液系统恶性疾病和实体瘤中含量减少。

目前，对AHSG基因的研究较多侧重于其与糖尿病、子宫内膜癌、神经胶质瘤及骨密度的关系［9］，有关AHSG基因与肠道肿瘤、肺癌、乳癌、肝癌等恶性肿瘤的关系的研究也有报道［3-6］，提示AHSG可作为恶性肿瘤的一种血清学标志物用于肿瘤的诊断。作者采用基因工程方法，对AHSG进行了克隆、重组表达并纯化，得到了较纯的AHSG融合蛋白，为进一步评价AHSG在常见肿瘤诊断中的价值奠定了基础。

［1］Mathews ST，Deutsch DD，Iyer G，et al.Plasma alpha2-HS glycoprotein concentrations in patients with acute myocardial infarction quantified by a modified ELISA［J］.Clin Chim Acta，2002，319(1):27

［2］陈学彬.人脑胶质瘤AHSG的相关性研究进展［D］.苏州:苏州大学，2006.

［3］Swallow CJ，Partridge EA，Macmillan JC，et al.α2 HS-glycoprotein，an antagonist of transforming growth factor β in vivo，inhibits intestinal tumor progression［J］.Cancer Res，2004，64(18):6402

［4］刘彦.人肺鳞癌相关差异表达基因和基因表达谱的研究［D］.北京:中国协和医科大学，2007.

［5］Yi JK，Chang JW，Han W，et al.Autoantibody to tumor antigen，alpha 2-HS glycoprotein:a novel biomarker of breast cancer screening and diagnosis［J］.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2009，18(5):1357

［6］聂轶飞，王凯娟，代丽萍，等.肝癌相关抗原血清学自身抗体反应分析［J］.中国公共卫生，2007，123(7):801

［7］Deng HW，Xu FH，Davies KM，et al.Differences in bone mineral density，bone mineral content，and bone areal size in fracturing and non-fracturing women，and their interrelationships at the spine and hip［J］.J Bone Miner Metab，2002，20(6):358

［8］Szweras M，Liu D，Partridge EA，et al.Alpha2-HS glycoprotein/fetuin，a transforming growth factor-beta/bone morphogenetic protein antagonist，regulates postnatal bone growth and remodeling［J］.J Biol Chem，2002，277(22): 19991

［9］Kalaby L，Cseh K，Pajor A，et al.Correlation of maternal serum fetuim/alpha 2-HS-glycoprotein concentration with maternal insulin resistance and anthropometric parameters of neonates in normal pregnancy and gestational diabetes［J］.Eur J Endocrinol，2002，147(2):243

Prokaryotic expression，purification and immunological analysis of recombinant alpha2-Heremans-Schmid glycoprotein

WANG Peng1，2)，REN Pengfei1)，DAI Liping1，2)，WANG Kaijuan1，2)，ZHANG Jianying1，2)1)Department of Epidemiology，College of Public Health，Zhengzhou University，Zhengzhou 4500012)Henan Key Laboratory of Tumor Epidemiology，Zhengzhou 450052

alpha2-Heremans-Schmid glycoprotein;prokaryotic expression;protein purification;antigenicity

Aim:To express and purify recombinant alpha2-Heremans-Schmid glycoprotein(AHSG)with biological activity.Methods:The total RNA from HepG2 cells was extracted and cDNA was synthesized.AHSG gene was amplified by RT-PCR method，then cloned on pMD18-T vector.The constructed clone plasmid was transformed into E.coli DH5α，then the fragments of AHSG acquired from that were ligated with pET-30a(+)vector.The recombinant AHSG protein was expressed after the constructed expression plamid was tranformed into E.coli BL21(DE3)and purified by Nickel ion affinity chromatography.The purified products were identified and analyzed by SDS-PAGE and Western blot，and the concentration of purified protein was measured.Results:The prokaryotic expression system BL21(pET30a-AHSG)was constructed successfully.The most appropriate condition for the expression of target protein was 80 μmol/L IPTG for 3 h.A fusion protein approximately 54 600 was yielded，mainly existing in the form of insoluble inclusion bodies.The highest concentration of recombinant protein purified by Nickel ion affinity chromatography was up to 2.3 g/L.The recombinant protein had antigenicity identified by Western blot.Conclusion:The prokaryotic expression system of AHSG and protein purification system have been successfully constructed and the purified AHSG recombinant protein is highly antigenic and immunogenic.

Q789

10.3969/j.issn.1671-6825.2012.01.003

*国家自然科学基金面上项目资助 30872962

(2011-07-03收稿 责任编辑王 曼)