4mm和6mm做为直径90mm平皿中水解酪蛋白琼脂的厚度的对比分析

李医 原霞 王宝银

抗菌药物敏感性试验是一种用于考察药物抗菌活性的体外实验，一般被用于抗菌药物的初期筛选及对抗菌药物的临床疗效进行预测。由于抗菌药物敏感性试验的实验结果将直接影响到临床使用抗菌药物的初期筛选，因此保证抗菌药物敏感性试验的准确合理十分重要［1］。细菌对抗生素的敏感试验有多种方法，大多数实验室采用传统的琼脂扩散法，即K-B法。所使用的培养基是以水解酪蛋白为主要成分的M-H培养基。影响药敏试验的因素也很多，如培养基的配制量、细菌接种量、药敏纸片的质量、纸片含药的准确性和均匀性等，这其中培养基的配制量又是重中之重，有研究证明，平板每增厚或减薄1 mm抑菌圈相应减少或增大0.7mm。然而在包括操作规程在内的所有资料中显示“水解酪蛋白倾制平板，琼脂平板厚度为4mm±1mm”。经过反复测试后，得出了4mm琼脂厚度只相当于在直径90mm平皿中加入了17毫升的培养基。但是在水解酪蛋白琼脂粉的配制说明中却提到“用吸管吸取25ml培养基倾注直径90mm灭菌平皿中”。对25ml水解酪蛋白制成的培养皿进行反复测量后，得出了其厚度相当于6mm。这两种说法之间出现了偏差，它们之间相差了2mm、8ml之多。那么到底是用4mm厚度做为直径90mm灭菌平皿中M-H培养基的倾注厚度，还是用6mm厚度做为直径90mm灭菌平皿中M-H培养基的倾注厚度呢?鉴于上述问题，本文在同一条件下分别以4mm倾注厚度和6mm倾注厚度做为两个不同测量单位，对四种质控菌株进行了30次试验，测量其抑菌圈的直径并把测量的结果与“4种非苛养菌质控菌株对部分抗菌药物的抑菌环允许范围”进行对比，力图为K-B法手工配置的M-H培养基的倾注厚度提供较为准确的依据和参考。

仪器与材料

一、材料和试剂

1.架盘天平(浙江省慈溪市天东衡器厂);压力蒸汽灭菌器(山东威高集团医用高分子制品有限公司);90mm培养皿和30ml注射器(江苏康健医疗用品有限公司);比浊仪和0.85%NaCl(法国梅里埃公司);水解酪蛋白琼脂(杭州天和微生物试剂有限公司);配置用水(武汉江汉医疗制药有限公司生产的水处理装置制备的纯净水);药敏纸片(英国Oxoid公司);药敏判读按照美国临床实验室标准化委员会(CLSI)2009年版的标准判读。

2.质控菌株 ATCC25922大肠埃希氏菌;ATCC25923金黄色葡萄球菌;ATCC35218含酶大肠埃希菌;ATCC27853铜绿假单胞菌;均购自卫生部临检中心.

3.质控菌株的保存 每次从血平板上挑取菌落接种于营养肉汤后装成10支小瓶放于-20℃保存，每周一取1支转种于血平皿上，周二再传代1次，周三进行药敏试验。用到最后1支时继续前面的操作。

二、方法

1.采用K-B法分别用琼脂厚度为4mm和琼脂厚度为6mm的M-H培养基监测四种非苛养菌质控菌株对抗菌药物的抑菌环直径并与质控菌株的抑菌环允许范围进行比较。具体药名见表1。

2.培养基的制备 按要求称取一定量水解酪蛋白琼脂，加入纯净水，待完全溶解后放到电子万用炉上加热，然后放入高压蒸汽灭菌器内，121℃15分钟高压，高压后取出并放入已消毒好的超净工作台内，待自然冷却至50℃左右，将其倒入同时进行高压的无菌缸内，用30ml注射器吸取17ml和25ml分别放入无菌平皿中(在使用新注射器时先做一个“吸入-弃去”的动作)，制成M-H培养基备用。每周配制一次。

3.制备菌液 菌液浓度调至0.5麦氏比浊标准。

4.接种平板用新的无菌棉签蘸取调好的菌液，在液面上方管壁处旋转挤压几次，挤掉过多的菌液。再用棉签在无菌的稍干燥的M-H培养基表面涂布，每次将平皿旋转60度，反复涂布6次，最后用棉签涂抹琼脂的边缘。每根棉签最多涂抹2个平皿。待培养皿吸收3～5分钟的水分后，开始贴药敏纸片。

5.贴药敏纸片 药敏纸片已事先从冰箱中取出并恢复了室温，将抗菌药物纸片贴于接种好的琼脂平板表面。贴一个纸片用镊子压一下，并经火焰灭菌镊子尖。每个平板贴5个纸片［2］。贴完纸片后，在室温放置了10分钟，并将平板倒过来，置于35℃温箱中。

6.读取结果 孵育18～24h后，观察结果。菌液浓度合适且涂布好，抑菌圈为正圆形，菌落呈融合生长。在黑色不反光的背景将直尺置于反转的平板背面量取抑菌环直径，单位为毫米。三、统计学分析

应用SPSS13.0统计软件进行统计学分析，计数资料的组间比较采用χ2检验，P值＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1.在ATCC25922大肠埃希菌中，具有非常显著性意义(P值＜0.01)的药物有氨苄西林/舒巴坦、左旋氧氟沙星、头孢呋辛、美罗培南、呋喃妥因、复方新诺明、头孢哌酮/舒巴坦，而具有显著性意义(P＜0.05)的药物有氨苄西林、头孢噻肟。

2.在ATCC25923金黄色葡萄球菌中，具有非常显著性意义(P值＜0.01)的药物有左旋氧氟沙星、呋喃妥因、苯唑西林，头孢西丁，而具有显著性意义(P＜0.05)的药物有青霉素、磷霉素。

3.在ATCC27853铜绿假单胞菌中，具有非常显著性意义(P值＜0.01)的药物有环丙沙星、左旋氧氟沙星、头孢他啶，具有显著性意义(P＜0.05)的药物有氨曲南、头孢吡肟。

4.在ATCC35218含酶大肠埃希菌中，具有非常显著性意义(P值＜0.01)的药物有氨苄西林/舒巴坦、头孢哌酮/舒巴坦，而具有显著性意义(P＜0.05)的药物有阿莫西林/克拉维酸。

5.结果分析从表2-表5中可以看出:P值＜0.01的药物有10种，说明用17ml做为M-H培养基中水解酪蛋白的灌注量对这10种药物的结果具有非常显著的影响。P值＜0.05的药物有7种，说明用17ml做为M-H培养基中水解酪蛋白的灌注量对这7种药物的结果具有显著的影响。而其中氨苄西林/舒巴坦、左旋氧氟沙星、呋喃妥因这3种药物出现的频率最多，其结果受到的影响也最为明显，说明这3种药物所受到的影响具有普遍性。

表2 ATCC25922大肠埃希菌

表3 ATCC25923金黄色葡萄球菌

表4 ATCC27853铜绿假单胞菌

表5 ATCC35218含酶大肠埃希菌

讨 论

临床微生物实验室的一项重要内容是对病源微生物进行药敏试验，测定其对抗菌药物的敏感程度，这对临床医师合理选用抗生素，有效控制感染，避免滥用抗生素防止耐药株的出现，具有重要意义。

然而药敏试验中整个过程的关键点就是药敏培养基的质量，前面也提到平板每增厚或减薄1 mm抑菌圈相应减少或增大0.7 mm［3］。而在本次试验中所得到的数据为M-H培养基的量每增加4 ml抑菌圈的直径增大0.9335 mm，与上述的数据相近。这说明在日常工作中药敏结果会受到M-H培养基中水解酪蛋白的量的影响。培养基的配制量应该是保证一切药敏结果质量的源头，如果其准确度从源头上就遭到质疑那对以后的结果将起到影响。

1 李薇，宋新波，习利平.药物敏感性试验中不同方法灵敏度的比较及助溶剂的筛选［J］.时珍国医国药，2010，21(8):2062.

2 Andrews JM.For the BSAC working party on susceptibility testing.BSAC standardized disc susceptibility testing method.J Antimicrob Chemother，2011，48(suppl)1:43-57.

3 张彩芳，张爱君.纸片扩散法药敏试验条件的选择［J］.宁夏医学杂志，2006，28(12):946-947.