CDK5在鱼藤酮诱导的多巴胺能神经元凋亡中的作用

黄 杰 张振涛 陈春暖 王洪财 熊 婧 王 涛

帕金森病 （Parkinson’s Disease，PD）是一种常见的神经系统变性疾病，其病因和发病机制至今尚未阐明。有研究表明细胞周期调节因子的表达异常所引发的神经元凋亡是许多神经变性疾病的发病机制之一［1］。细胞周期素依赖性蛋白激酶5（cyclin－dependent kinase5，CDK5）是一种主要在神经元内表达的细胞周期分子，参与神经系统发育过程，而且与许多神经退行性疾病的发病相关［2］。有研究发现CDK5参与阿尔茨海默病的神经变性过程，且PD患者剖检标本中CDK5表达也有增高［3］，但其是否参与PD发病尚未见报道。本研究采用多巴胺能细胞系SH－SY5Y细胞，利用鱼藤酮毒素建立PD细胞模型来研究CDK5在PD神经元损伤中的作用。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验细胞 人神经母细胞瘤细胞系（SHSY5 Y）由华中科技大学同济医学院药理学系提供。

1.1.2 实验试剂 DMEM F12培养基购自Gibco公司，胎牛血清购Gibco自公司。四甲基氮唑盐（MTT）、鱼藤酮、Annexin－V／PI凋亡试剂检测盒、药品Olomoucine、MDL28170均购于Sigma公司，兔抗人CDK5、p35／25抗体购自Santa Cruz公司，其余试剂均为国产分析纯。

1.2 细胞培养 SH－SY5Y置于DMEM F12培养基中，内含10%（体积分数）灭活胎牛血清、青霉素100U／L、链霉素100U／L，于5%（体积分数）CO2、37℃培养箱内进行培养，隔天换液。

1.3 MTT法检测细胞活力 调节SH－SY5Y细胞密度约2×105／m L，以100μL／孔接种于96孔板，分别加入不同浓度的鱼藤酮处理24 h，每种处理5个复孔，每孔加入5 mg／m L MTT10μL，继续培养4h；弃培养基，每孔加二甲基亚砜100μL，37℃孵育20 min，至颗粒溶解，在酶标仪上测定570 nm的吸光度［OD］值，将OD值作为反映SH－SY5Y细胞活性和代谢状况的参数；细胞存活率＝试验组OD570 n M值／对照组OD570 n M值×100%。

1.4 细胞分组及药物处理

细胞传代培养至5 m L培养瓶中，待细胞长满70%～80%后给予药物处理。鱼藤酮、Olomoucine、MDL28170均用DMSO溶解，使DMSO在细胞培养液中的终浓度小于0.4%。实验分四组：A组为溶剂空白对照组；B组为单纯10μmol／L鱼藤酮组；C组为30μmol／L MDL28170＋10μmol／L鱼藤酮组；D 组这100μmol／L Olomoucine＋10 μmol／L鱼藤酮组（Olomoucine、MDL28170预处理细胞2 h后再加入鱼藤酮）。以上四组细胞将分别在药物处理24 h和48 h两个时间点进行流式细胞术检测凋亡以及采用 Western－blot法检测相关蛋白的表达。

1.5 磷脂结合蛋白（Annexin－V）－碘化丙啶（propidium iodide，PI）双染色检测细胞凋亡经药物处理后于指定的时间点收获细胞，用不含EDTA的胰酶消化各组SH－SY5Y细胞，离心1200 r／min，制成单细胞悬液，调整细胞密度为5×105／ml，取100μl细胞悬液，加入buffer缓冲液使反应体系至400μl，分别加入5μl Annexin－V／FITC和10μl PI溶液，混匀后室温避光孵育15 min。通过流式细胞仪（美国BD公司）检测凋亡。

1.6 免疫印迹法（Western blot）检测不同组细胞CDK5、p35、p25的蛋白表达水平 取处理足够时间的不同实验组细胞，吸弃培养液，加入适当裂解液裂解细胞，将细胞从培养瓶刮下，混匀，1200 r／min离心5 min，吸上清液，用Brandford法检测蛋白浓度后加入上样缓冲液煮沸5 min，取适量样品进行SDS－PAGE电泳分离，分离的蛋白用湿法电转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h；分别用兔抗人CDK5、p35／25一抗4℃孵育膜过夜，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗室温孵育2 h，化学发光法显色，显影及曝光；同时以β－actin作为内参；实验重复三次。

1.7 统计学处理

应用SPSS 10.0统计软件，实验数据采用均数±标准差（±s）表示，多组间比较用方差分析（ANOVA），组间比较采用Tukey’s检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 鱼藤酮对细胞活力及代谢的影响

经鱼藤酮处理细胞24 h后细胞活力发生了变化，细胞活力呈量效依赖性降低（图1）。经0.5、1、2、5、10、50、100μmol／L鱼藤酮处理24 h后细胞活力分别下降至对照组的（86.84±1.61）%、（72.36±6.22）%、（65.31±4.27）%、（65.06±3.73）%、（55.75±0.80）%、（26.61±0.59）% 和 （19.21±1.83）%（P＜0.01）。

图1 不同浓度鱼藤酮作用24 h后对细胞活力的影响与对照组比较，＊P＜0.01

2.2 鱼藤酮及CDK5抑制剂对细胞凋亡的影响

B组在24 h及48 h时间点的细胞凋亡率明显高于A组 （表1）。采用两种不同CDK5阻滞剂MDL28170和Olomoucine预处理细胞，细胞凋亡率与B组相比有明显下降。（24 h con vs rot q＝13.76 rot vs mdl q＝7.661 rot vs olo q＝10.13；48 h con vs rot q＝14.0 rot vs mdl q＝6.852 rot vsolo q＝7.764以上P均＜0.05）。

表1 各组的细胞凋亡率百分比的比较

2.3 各组细胞形态学改变

A组细胞突起明显，细胞透明，形态多样。鱼藤酮作用24 h后细胞突起明显减少皱缩，细胞变圆，胞体内颗粒物增多，鱼藤酮处理48 h后两者对比更加显著，并且在24、48 h两个时间点 MDL28170预处理组、Olomoucine预处理组的细胞形态学改变介于A组与B组之间（图2 A－H）。

图2 各组细胞形态学变化（×400倍）

2.4 各组细胞CDK5、p25／p35表达水平

在鱼藤酮处理24 h后细胞内CDK5的表达较对照组明显增加（图3，A组vs B组，P＜0.05），而MDL28170和Olomoucine处理后的细胞CDK5的表达则不同程度的低于B组（图2，B组vs C组、D组P＜0.05），在药物作用48 h时间点鱼藤酮组CDK5表达更高，但药物处理组仍然能看到CDK5的活性被抑制（24 h con vs rot q＝25.35；rot vs mdl q＝12.31；rot vs olo q＝11.36；48 h con vs rot q＝27.45；rot vs mdl q＝9.259；rot vs olo q＝9.198以上P均＜0.05）

图3 各组及不同时间点的CDK5表达水平（以CDK5的相对OD值的平均数来表示） 与A组比较，＊P＜0.05；与各组比较，△P＜0.05；与C组比较，▲P＜0.05

鱼藤酮处理细胞24 h后细胞内表达p25／p35的比值增加，明显高于A组，而MDL28170（一种钙调蛋白激酶抑制剂）通过抑制p35向p25的转化，使p25／p35比值低于B组。48 h时MDL组仍能看到对p35向p25的转化抑制。24和48h时间点Olomoucine也能降低p35→p25的转换（24 h con vs rot q＝36.06 rot vs mdl q＝40.36 rot vs olo q＝19.52；48 h con vs rot q＝82.07 rot vs mdl q＝42.81 rot vs olo q＝46.12以上P 均＜0.05）（图4）。

图4 各组在不同时间点的p25／p35表达比 与A组比较，＊P＜0.05；与B组比较，△P＜0.05；与C组比较，▲P＜0.05

3 讨 论

CDK5是一种脯氨酸限定的丝／苏氨酸蛋白激酶，是细胞周期依赖性蛋白激酶家族中的一员。但其并不直接参与细胞周期的调节。CDK5主要通过对其众多底物的磷酸化来参与神经元生物活性的调节。研究显示CDK5在神经发育过程中起着关键作用，它通过调节在辐射迁移过程中神经元与胶质细胞的相互作用，使皮质分层结构最终形成。CDK5还参与神经元分化和轴突的形成，并且在细胞运动和粘附，突触可塑性，药瘾形成，以及神经退行性疾病中都扮演着重要角色［2］。

由于CDK5的主要激活物p35／p25主要在神经系统表达，所以其在神经系统疾病研究中被广泛重视。在PD患者剖检标本中的黑质、蓝斑和新皮质的路易体中能检测到CDK5和p35［3］。此外在剖检的PD患者扣带回脑组织中还发现，p25／p35蛋白的比例增加［4］。这些都提示CDK5与PD发病机制密切相关。

通常认为CDK5主要被p35和p25活化。在病理状态下，p35被激活的钙调蛋白激酶（μ－calpain）水解为p25，而p25较p35难于水解，所以CDK5与p25结合后就使CDK5过度活化，过度激活的CDK5激发下游分子而引发一系列改变［5］。Smith等通过在MPTP诱导的大鼠PD模型研究中发现，MPTP诱导p25的表达增加，进而使CDK5／p25复合物过度活化，最终诱发神经元凋亡［6］。本研究首先采用鱼藤酮处理SHSY－5Y细胞来复制PD细胞模型。本实验表明，经鱼藤酮处理后细胞内CDK5的表达、p25／p35的比值较未用鱼藤酮处理组上升，而鱼藤酮能明显诱发细胞凋亡，结合前人研究结果，本研究推测CDK5与细胞凋亡相关。然后，本研究通过钙调蛋白激酶的抑制剂MDL28170来预处理细胞，发现MDL28170能抑制p35水解为p25，从而降低CDK5的活化表达，来保护鱼藤酮毒素诱发的细胞凋亡。同时我们利用CDK5的阻滞剂Olomoucine来直接干预细胞，通过降低CDK5的活性而对抗凋亡。有趣的是Olomoucine并不具有抑制钙调蛋白激酶的作用，本研究推断，由于CDK5活性被Olomoucine抑制，使CDK5自身磷酸化p35来促进p35降解的过程被减弱［7］，所以实验中我们观测到Olomoucine也能一定程度抑制p25／p35的比值上升。

CDK5促进神经元凋亡的机制目前尚不明确。有研究显示，MEF－2（肌细胞促进因子2）是一个抗凋亡的转录因子，能被p38、MAPK、ERK5磷酸化而激活。CDK5通过444位点的丝氨酸磷酸化MEF－2后，阻止了 MEF－2的拮抗凋亡作用而促进凋亡［8］。Kim等认为p25／CDK5的活化能够抑制组蛋白去乙酰化酶 （histone deacetylase，HDAC1）的活性，从而使细胞周期相关基因表达细胞周期异常重启，DNA双链断裂，从而诱发细胞凋亡［9］。在鱼藤酮诱导多巴胺能神经元凋亡的过程中是否引发上述过程，值得我们进一步深入研究。

总之，本研究结果表明，CDK5在鱼藤酮诱导多巴胺能神经元凋亡的过程发挥着重要作用，通过直接抑制CDK5的表达，或通过抑制p35水解为p25来降低CDK5的活化都能在鱼藤酮PD细胞模型中发挥对抗凋亡的保护作用。

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3 Nakamura S，Kawamoto Y，Nakano S，et al.p35nck5a and cyclin－dependent kinase 5 colocalize in Lewy bodies of brains with Parkinson＇s disease.Acta Neuropathol（Berl.），1997，94（2）：153－157.

4 Daniel Alvira，Isidre Ferrer，Javier GC，et al.Activation of the calpain／cdk5／p25 pathway in the girus cinguli in Parkinson＇s disease.Parkinsonism and Related Disorders，2008，14（4）：309－313.

5 Patrick GN，Zukerberg L，Nikolic M，et al Conversion of p35 to p25 deregulates Cdk5 activity and promotes neurodegeneration.Nature，1999，402（6762）：615－622.

6 Smith PD，Crocker SJ，Jackson LV，et al.Cyclin－dependent kinase 5 is a mediator of dopaminer－gic neuron loss in a mouse model of Parkinson＇s disease.Proc Natl Acad Sci，2003，100（23）：13650－13655.

7 Patrick GN，Zhou P，Kwon YT，et al.The neuronal－speci？c activator of CDK5 is degr－raded by the ubiquitin－proteasome pathway.Biol Chem，1998，273（37）：24057－24064.

8 Smith PD，Mount MP，Shree R，et al.Calpain－regulated p35／cdk5 plays a central role in dopaminergic neuron death through modulation of the transcription factor myocyte enhancer factor 2.Neurosci，2006，26（2）：440－447.

9 Kim D，Frank CL，Dobbin MM，et al.Deregulation of HDAC1 by p25／Cdk5 in Neurotoxicity.Neuron，2008，60（5）：803－817.