溶血磷脂酸对小胶质细胞炎性分泌的影响

付佩彩 喻志源 刘 淼 唐荣华 王 伟 骆 翔

小胶质细胞约占成年中枢神经系统细胞总量的10%－20%［1］。它是CNS原位免疫细胞，属于单核细胞系，介导中枢神经系统对感染、损伤等疾病的先天性免疫反应［2］。在CNS受损后小胶质细胞迅速激活，迁移至受损部位，并发生一系列特征性反应，如细胞增殖、形态改变、炎性因子分泌等［3］。LPA为类生长因子的脂类信号分子，与CNS损伤密切相关，它即是反应CNS受损程度的预警因子，也可作为致病因子促进CNS进一步损伤［4，5］。本研究采用LPA对小胶质细胞系BV2细胞进行干预，检测BV2细胞活化分泌IL－1β和TNF－α的浓度变化，以探讨LPA在CNS损伤中对小胶质细胞活化以及炎性因子分泌中的作用。

1 方法与材料

1.1 材料与试剂

BV2细胞系来自华中科技大同济医学院。DMEM／高糖培养基、胎牛血清均购自美国Hyclone公司；胰蛋白酶购自美国GIBCO公司；多聚赖氨酸、LPA（溶血磷脂酸）和DAPI均购自美国sigma公司；LDH试剂盒购自南京建成生物研究所；ELISA试剂盒购自深圳达科为生物技术有限公司；小鼠抗Iba1购自美国Wako公司；CY3标记羊抗兔IgG购自美国Jackson公司。

1.2 BV2细胞复苏及传代培养

液氮冻存的BV2细胞，37°C迅速复苏后用含10%胎牛血清的DMEM／高糖培养基进行培养，当细胞达到90%融合时用0.25%胰酶消化细胞，进行传代。

1.3 实验分组

调整BV2细胞悬液中细胞密度为1×106／ml，接种于多聚懒氨酸（0.1 mg／ml）包被过的6孔板中，于37°C 5%CO2培养箱中进行培养，24 h应用于实验。其中对照组在实验开始时换用新鲜培养基，LPA组换用含10μM LPA的新鲜培养基。

1.4 LDH法检测细胞培养基中LDH浓度

LDH法检测10μM LPA作用于BV2细胞后培养基内LDH含量，以检测LPA对BV2细胞毒性作用。严格按照试剂盒说明书要求操作，反应结束室温5 min后用450 nm波长测定各孔吸光度。绘制标准曲线，依据标准曲线计算各孔相应的LDH浓度。

1.5 ELISA法检测细胞培养基中IL－1β和TNF－α浓度

ELISA法测定IL－1β和TNF－α浓度，操作严格按照试剂盒说明书要求进行。终止反应10分钟内用检测波长450 nm，参考610 nm波长测定各孔吸光度。绘制标准曲线，依据标准曲线计算各孔相应的IL－1β和 TNF－α浓度。

1.6 统计学处理

所得数据用均数±标准差表示，组间比较采用t检验，应用SPSS软件，P＜0.05认为差异有统计学意义。用sigma plot作图软件作图。

2 结 果

2.1 BV2细胞Iba1免疫荧光染色鉴定

传代培养的BV2在培养24 h后贴壁细胞呈梭形，至第2～3 d BV2细胞生长呈90%融合，突起明显增多延长。将BV2细胞做Iba1免疫荧光染色，证明传代培养的BV2细胞表达小胶质细胞特异性抗原Iba1（图1）。

2.2 BV2细胞分泌LDH的浓度变化

对照组和LPA组在各时间点（30min、1、3和6 h）的LDH分泌均无明显差异（图2）。

2.3 BV2细胞分泌IL－1β和TNF－α的浓度变化

LPA干预BV2细胞后1 hIL－1β和TNF－α较对照组显著增加（P＜0.01）。IL－1β分泌在3 h达到峰值，而TNF－α分泌在6 h内持续增高。与对照组比较，IL－1β和TNF－α均在3 h增加最显著（P＜0.01）（图3、4）。

图1 BV2细胞的小胶质细胞特性鉴定 培养的BV2细胞100%表达小胶质细胞特异性抗原Iba1；红色为Iba1染色阳性，蓝色为细胞核DAPI染色

图2 各组分泌LDH浓度

图3 各组BV2细胞培养液中TNF－α的浓度（与同时间点对照组比较，＊P＜0.01）

图4 各组BV2细胞培养液中IL－1β的浓度（与同时间点对照组比较，＊P＜0.01）

3 讨 论

小胶质细胞为CNS定居的免疫细胞，是CNS损伤后最早发生反应的细胞类型［6］。活化的小胶质细胞可通过吞噬死亡细胞碎片、限制炎症病灶扩大［7］、形成胞突包绕神经轴突末梢、分泌小胶质细胞源性神经营养因子等作用对CNS损伤起到保护作用。但过度活化的小胶质细胞亦可导致神经损伤，CNS缺血区域的神经细胞可通过 ATP、CCL2／CCR2趋化因子受体途径以及组织蛋白酶S／CX3CL1途径激活小胶质细胞，诱导小胶质细胞产生炎性反应，分泌各种炎症因子（TNF－α，IL－6，IL－1β）进而加重受损神经元的损伤［8～10］。虽然关于小胶质细胞炎性因子释放的研究众多，但其炎性释放机制仍未明确。

LPA是血清中的正常组分之一，血小板、炎症细胞、神经细胞、损伤细胞和内皮细胞受到各种刺激后均可生成，通过内分泌和旁／自分泌的方式释放。在CNS受损后LPA的分泌增加并可促进CNS系统进一步损伤，但其机制未明确［4，5］。本研究结果发现LPA可显著促进小胶质细胞系BV2细胞的活化，并促进其分泌IL－1β和TNF－α（P＜0.01），在3 h其促进作用最为显著。已知的LPA可通过G12／13蛋白激活Rho／ROCK信号通路［11］，LPA可通过激活Rho后发挥细胞骨架重建、肌动蛋白应力纤维重建、细胞分化等作用。并有研究显示抑制Rho／ROCK通路、可明显抑制小胶质细胞炎性因子（TNF－α、IL－6、IL－1β）释放［12］。因此，本研究推测LPA促进小胶质细胞炎性分泌可能为激活Rho／ROCK通路所致。

综上所述，本研究结果提示LPA在小胶质细胞活化及其炎性分泌中发挥了重要作用；LPA促进小胶质细胞炎性因子分泌可能为其促进CNS损伤的原因之一，也为进一步了解CNS损伤后LPA的作用、小胶质细胞的活化机制及其调控方法提供了实验依据。

1 Lawson LJ，Perry VH，Dri P，et al.Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normal adult mouse brain.Neuroscience，1990，39（1）：151－170.

2 Streit WJ，Conde JR，Fendrick SE，et al.Role of microglia in the central nervous system＇s immune response.Neurol Res，2005，27（7）：685－691.

3 Haynes SE.The P2Y12 receptor regulates microglia activation by extracellular nucleotides.Nature Neurosci，2006，9（12）：1512－1519.

4 Siess W.Athero－and thrombogenic actions of lysophosphatidic acid and sphingosine－1－Phospate.Biochim Biophys Aeta，2002，1582（13）：204－215.

5 Siess W，Tigyi G.Thrombogenic and atherogenie activities of lysophosphatidic acid.J Cell Bioehem，2004，92（6）：1086－1094.

6 Hanisch UK，Kettenmann H.Microglia：active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain.Nat Neurosci，2007，10（11）：1387－1394.

7 Davalos D.ATP mediates rapid microglia response to local brain injury in vivo.Nature Neurosci，2005，8（6）：752－758.

8 Gonzalez R，Glaser J，Liu MT，et al.Reducing inflammation decreases secondary degeneration and functional deficit after spinal cord injury.Exp Neurol，2003，184（1）：456－463.

9 Pan W，Kastin AJ.Cytokine transport across the injured bloodspinal cord barrier.Curr Pharm Des，2008，14（16）：1620－1624.

10 Sharma HS.Pathophysiology of blood－spinal cord barrier in traumatic injury and repair.Curr Pharm Des，2005，11 （11）：1353－1389.

11 Kyoko Noguchi，Deron Herr，Tetsuji Mutoh.Lysophosphatidic acid（LPA）and its receptors.Neurosciences，2009，9（1）：15－23.

12 Jing Ding，Qin－Ying Li，Xin Wang，et al.Fasudil protects hippocampal neurons against hypoxia－reoxygenation injury by suppressing microglial inflammatory responses in mice.Journal of Neurochemistry，2010，114（6）：1619－1629.