和田苜蓿组织培养中玻璃化现象研究

2012-06-04王庭辉马晖玲

草原与草坪 2012年5期

王庭辉，马晖玲

（甘肃农业大学草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中－美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃兰州 730070）

紫花苜蓿（Medicago sativa）属豆科多年生植物，是世界上最重要的饲料作物，有“牧草之王”的美称，目前世界苜蓿栽培面积为3500万hm2，在我国已有2000年的栽培历史［1］。自1958年Renert和Steward从胡萝卜愈伤织和悬浮细胞体系中获得体细胞胚以来，植物组织培养技术得到了迅速发展。随着组织培养技术的不断完善，使得生物技术在育种上的应用成为了可能，大大加快了我国牧草育种的进展［2］。王发生等［3］对紫花苜蓿愈伤组织诱导及植株再生做了详细研究。但是，在植物组织培养过程中超度含水态苗［4，5］，由于其难以移栽成活，严重影响植物组织培养技术的发展和应用。1981年Debergh等［6］提出了试管植物“玻璃化作用”的概念。陈兵先等［7］对植物组织培养中玻璃化现象做了详细报道。

通过组培体系获得转基因植株，是目前生物技术手段改良植物品种的途径之一，而组培过程中出现的污染，褐化和玻璃化是影响植物组培体系建立的3大难题［8］，随着转基因技术的发展，组培体系显得尤为重要。陶铭［9］通过研究发现导致再生苗玻璃化的原因主要有培养基、培养容器、环境条件及外植体种类等，但其诱发机理至今尚无定论。李云霞等［10］以新疆大叶，甘农三号和陇东苜蓿为试材，对紫花苜蓿组培体系中常见褐化原因进行了分析并提出了解决办法。吴丽芳等［11］对紫花苜蓿组织培养中常见问题也提出了解决对策。同时，亓建飞等［12］对组培中畸形苗的发生机理做了阐述。拟通过摸清影响和田苜蓿组织培养过程中玻璃化现象产生的部分因素，提出应对措施，为消除紫花苜蓿组织培养过程中的玻璃化现象提供一定的参考依据。

1 材料和方法

1.1 材料

成熟的和田苜蓿种子采自新疆和田地区民丰县苜蓿原种站。

1.2 方法

挑选饱满颜色较好的新疆和田苜蓿种子，用自来水浸泡40min，用75%酒精处理30s，后用0.1%升汞浸泡10min，无菌水冲洗4～5次，将种子表面的升汞冲洗干净，接于MS培养基中，室内自然光光照培养，待种子萌发至2～3cm，取其下胚轴为外植体，切成0.5cm×0.5cm的小块，转接于 MS＋2.0mg/L 2，4－D＋3%蔗糖＋0.7%琼脂［11］诱导愈伤组织，时间为20～25d（图1－1）。将愈伤组织转接到前期分化培养基，诱导芽分化培养基为 MS＋6－BA 0.5mg/L＋NAA 0.05mg/L＋琼脂0.9%［13］（图1－2），直至分化出幼小再生苗。

30～35 d后选取健康无污染的幼小和田苜蓿再生苗接种在MS基本培养基上，设置不同浓度6－BA和NAA的组合、不同蔗糖含量、不同琼脂浓度、不同光照强度作单因子处理，每个处理20株，每瓶5株，3次重复。培养条件：25～28℃，光照周期16h。

1.3 数据处理方法

在不同因素作用下，培养30d后，观察并统计组培苗出现玻璃化的情况，用SPSS17.0软件进行单因素的差异显著性分析，并按公式计算：

2 结果与分析

2.1 6－BA和NAA浓度对和田苜蓿再生苗玻璃化的影响

在添加20g/L蔗糖，7g/L琼脂的MS培养基中，添加不同浓度6－BA和NAA，在光照强度为1 000～1 200lx的条件下，接种继代培养后的和田苜蓿再生苗，接种30d后观察并统计结果（表1）。试验发现，随着6－BA和NAA浓度的升高，再生苗玻璃化率逐渐增大，当6－BA为2.0mg/L、NAA 为0.5mg/L时其增殖系数达到最大，为1.93，玻璃化率为38%；当6－BA为2.0mg/L、NAA 为1mg/L 时，其增殖系数为1.75，玻璃化率为60%（图1－3），研究表明，随着6－BA和NAA浓度的升高，和田苜蓿再生苗的玻璃化现象加重，而其再生苗增殖系数先升高后降低。综合考虑，选择2.0mg/L 6－BA＋0.5mg/L NAA为和田苜蓿再生苗分化的最佳激素浓度配比。

2.2 蔗糖浓度对和田苜蓿再生苗玻璃化的影响

将继代培养的分化苗接种于添加2.0mg/L 6－BA＋0.5mg/L NAA和7g/L的琼脂的MS培养基中并附加不同浓度的蔗糖，在光照强度为1 000～1 200lx的条件下，培养30d后观察统计结果（表2），随着蔗糖浓度的增加，再生苗的玻璃化率逐渐降低，当蔗糖浓度为30g/L时，其玻璃化率最低，为17%；增殖系数在增大的情况下又减小，当蔗糖浓度为20g/L的时候，其增殖系数达到最大，为1.63。当蔗糖浓度为20g/L和25g/L时，其增殖芽数最多，增殖系数差异不显著，并且玻璃化率比较低（图1－4），所以当蔗糖浓度为20～25g/L时适合和田苜蓿再生苗的生长。

表1 不同激素浓度下和田苜蓿再生苗玻璃化Table 1 Effect of different hormones combination on vitrification of hetian alfalfa

表2 不同蔗糖浓度下和田苜蓿再生苗玻璃化Table 2 Effect of sugar combination on vitrification of hetian alfalfa

2.3 琼脂浓度对和田苜蓿再生苗玻璃化的影响

在添加2.0mg/L 6－BA＋0.5mg/L NAA 和20 g/L蔗糖的MS培养基中加不同浓度的琼脂，光照强度为1 000～1 200lx的条件下，接种继代培养后的再生苗，30d后观察。试验结果发现，随着琼脂浓度的增大，其玻璃化率逐渐减小，当琼脂浓度为5g/L时，再生苗玻璃化现象最严重（表3，图1－5），玻璃化率达到78%。琼脂浓度为7g/L和8g/L时，其增殖系数差异性显著，玻璃化率差异性不显著，因此，选择7g/L的琼脂浓度作为和田苜蓿最佳的再生苗分化浓度。

表3 不同琼脂浓度下和田苜蓿再生苗玻璃化Table 3 Effect of agar combination on vitrification of hetian alfalfa

2.4 光照强度对和田苜蓿再生苗玻璃化的影响

在含2.0mg/L 6－BA＋0.5mg/L NAA＋20g/L蔗糖＋7g/L琼脂的培养基上，接种继代培养后的和田苜蓿再生苗，置于不同光照强度的培养箱进行培养，30d后观察。结果表明，随着光照强度增加，再生苗芽增殖能力先升高再下降，在光照强度为1 000lx时，增殖芽数最多，为25.67，其增殖系数最大；当光照强度为1 000lx和1 200lx时，其增殖系数差异性不显著。当光照强度为1 000lx和1 200lx时，和田苜蓿玻璃化苗情况不严重，玻璃化率明显低于其他2个光照强度（表4，图1－6）。因此，选择1 000～1 200lx的光照强度为和田苜蓿再生苗分化培养的光照强度。

表4 不同光照强度下和田苜蓿再生苗玻璃化Table 4 Effect of Light intensity on vitrification of hetian alfalfa

图1 和田苜蓿再生状况Fig.1 Regeneration of hetian alfalfa

3 讨论

玻璃化苗现象普遍存在于组织培养过程中，试管苗玻璃化严重影响了植物组织培养的效率和质量，因此，试管苗玻璃化问题的解决有助于整个植物组织培养的发展和其遗传体系的建立［14］。而且，在试管苗增殖过程中，一旦形成玻璃化苗，其增殖系数会明显下降，不利于继代和生根培养，降低了组培的效率［15］。在植物组织培养中，蔗糖一直被作为标准碳源，蔗糖的用量是组织培养成功与否的关键之一。成细华等［16］在结球白菜组织培养中发现，高浓度的蔗糖不仅不能克服玻璃化现象，而且抑制了不定芽的分化。因此，适当提高蔗糖浓度对培养壮苗很有必要［17］，何芳兰等［18］认为，增加蔗糖和琼脂的浓度，可以在不同程度上减少高山杜鹃试管苗玻璃化的发生，当琼脂浓度0.6%时，其玻璃化率低，增殖系数高。研究通过蔗糖和琼脂的不同浓度发现，在和田苜蓿的组织培养中，利用MS培养基，增加适宜浓度的琼脂，可以降低培养基的衬质势，造成细胞吸水阻遏，从而降低玻璃化。适当提高培养基中蔗糖含量，也可降低培养基中的渗透势，减少培养基中植物材料可获得的水分，降低玻璃化现象。

研究报道，玻璃化苗发生百分率和细胞分裂素成正相关，其中，6－BA的影响大于ZT和KT［19］。适当的激素组合可以降低试管苗的玻璃化。实验研究中，在MS＋2.0mg/L 6－BA＋0.5mg/L NAA 的培养条件下，和田苜蓿玻璃化程度降低，所以，和田苜蓿组织培养可通过调整6－BA（2.0mg/L）和 NAA（0.5mg/L）的作用浓度，降低和田苜蓿的玻璃化现象，并且其再生芽增殖较明显。研究建议今后这些措施可以应用于苜蓿组织培养过程中，消除玻璃化现象，提高苜蓿组织培养的效率。

在植物组织培养中，光照是影响培养效果的主要因子之一［20］。桂明春等［22］通过对橡胶树不定芽诱导的研究发现，光照强度能显著影响不定芽的生长和形态，不同光照强度下诱导出的不定芽嫩绿程度不同。研究发现，在和田苜蓿诱导分化阶段，光照强度对不定芽的再生和植物叶片的形态具有显著影响，当光照强度为1 000～1 200lx时，其不定芽嫩绿，玻璃化情况不严重。因此，不同的植物，选择适宜的光照强度对组织培养体系的建立具有重要作用。

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