三叶草根际溶磷菌溶磷及分泌IAA能力测定

张 英，朱 颖，姚 拓

（1.甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中－美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃 兰州730070；2.青海大学农牧学院 草业科学系，青海 西宁 810016）

植物根际中存在着大量的能够溶解磷矿粉的微生物［1－4］。长期以来，国内外的学者对溶磷微生物的种类和能力开展了广泛的研究［5－11］，取得了一些开拓性成果，但多年的实践结果也表明，溶磷微生物的实际应用效果并不理想，很多菌株在实验室条件下表现出明显溶磷能力，但应用到田间溶磷效果却不明显，难以适应不同的生长环境［12，13］。所以，从特定地区和植物根际筛选溶磷、适应能力强，兼有其他优良特性的菌株有着重要的意义。

白三叶（Trifolium repens）和红三叶（Trifolium pratense）为豆科车轴草属［14］多年生牧草。红三叶是优质的多年生牧草，同时又是良好的蜜源植物及绿肥植物，是优良的园林绿化及水土保持植物资源，植株中富含异黄酮类化合物，具有抗肿瘤（胃癌、乳腺癌），防治骨质疏松、改善更年期综合症等作用［15］，是一种极有开发前景的天然药材，是园林绿化、水土保持和水源涵养地建设的优良草本植物。

目前，有关车轴草属植物根际溶磷菌的研究报道较少。对分离自白三叶和红三叶草根际的10株溶磷细菌的溶磷能力和分泌IAA能力进行测定，筛选优良菌株，为溶磷菌菌株特性的研究和菌肥的开发利用提供优良用菌株资源。

1 材料和方法

1.1 菌株来源

供试菌株为前期［16－18］在兰州、定西、酒泉地区白三叶和红三叶根际分离、筛选获得的10株溶磷细菌（菌株编号为：ls1－3、ls1－5、ls2－11、ls2－12、ls2－16、ls3－1、ls3－2、ls3－5、lhs11、lhs4）。

1.2 培养基及试剂

LB培养基［19］，PKO 无机磷培养基［20］，蒙金娜有机磷培养基［17］，King培养基［21］，Spot比色液和 S2比色液［22］。

1.3 溶磷能力测定

1.3.1 定性测定 将LB斜面培养基中保存的菌株，活化后点接种于PKO无机磷和蒙金娜有机磷平板上，28℃恒温培养，第10d后观察、测量各菌株形成的溶磷圈大小。根据溶磷圈直径（D）和菌落直径（d）比值（D/d）初步确定菌株溶磷能力。

1.3.2 定量测定 将50mL液体PKO无机磷（或蒙金娜有机磷）培养基装入150mL三角瓶，121℃灭菌20min，冷却后，分别将500μL各待测菌株的菌悬液（108cfu/mL）接种至三角瓶中。每菌株设3个重复，以基础培养基（不接种菌株）为对照。将上述三角瓶置于28℃、160r/min摇床培养10d后，用酸度计测定培养液pH值。将培养液10 000r/min、4℃离心15 min，取上清液，用钼锑抗比色法测定有效磷增量（扣除对照后的值（mg/L））［23］。

1.4 分泌IAA能力测定

1.4.1 定性测定 将50mL液体King培养基装于150mL三角瓶，121℃灭菌20min，冷却后分别将500 μL各待测菌株菌悬液（108cfu/mL）接种至三角瓶中。每菌株设3个重复，以基础培养基（不接种菌株）为对照。将三角瓶置于28℃，129r/min摇床培养12d，取菌株悬浮液50μL滴置于白色陶瓷板上，同时加50 μL Spot比色液，对照只在比色液中加50μL 10mg/L的植物生长激素（3－吲哚乙酸）；将白色瓷板置室温下，在15min内观察其颜色变化，颜色变粉红者表示能分泌IAA，颜色越深表示分泌IAA能力越强；不变色为阴性，即不分泌IAA［22］。

1.4.2 定量测定 取上述培养12d的培养液10 000 r/min、4℃离心10min，取上清液1mL加1mL S2比色液在黑暗下静置30min，迅速用分光光度计比色（波长530nm）［22］，标准曲线用纯3－吲哚乙酸制作。

1.5 数据分析

数据处理采用SPSS 16.0软件，多重比较采用LSD法。

2 结果与分析

2.1 溶磷能力的测定

溶磷圈直径（D）、菌落生长直径（d）及比值（D/d）是表征溶磷菌相对溶磷能力的一个指标，可初步确定溶磷菌株的溶磷效果。对各菌株在PKO无机磷和蒙金娜有机磷固体培养基培养10d，用溶磷圈法分别测定了各菌株的D/d值（图1、2），结果表明，各菌株的D/d值大小差异显著（P＜0.05）。在PKO无机磷培养基上，各菌株的D/d值在1.07～1.52，其中，菌株ls1－3的 D/d 值 （1.52）最大，菌 株ls3－2 的 D/d 值（1.07）最小，菌株ls2－11，ls2－16和ls3－2的溶磷透明圈不明显。在蒙金娜有机磷培养基上，各菌株的D/d值在1.00～1.45，其中，菌株lhs1的D/d值（1.45）最大，菌株ls1－3、ls1－5、ls2－11、ls2－13的 D/d值为1，并发现各菌株无明显的溶磷透明圈。

图1 菌株在PKO培养基上的D/dFig.1 D/d vallue in PKO culture medium by phosphate－solub ilizing bacteria

图1 菌株在蒙金娜培养基上的D/dFig.2 D/d vallue in Mongoli culture medium by phosphate－solub ilizing bacteria

溶磷圈法只能定性测定各菌株溶磷能力。为进一步测定各菌株溶磷性强弱，将各菌株单独接种于PKO无机磷和蒙金娜有机磷液体培养基中10d后测定各上清液有效磷增量，结果各菌株都具有溶解磷酸三钙能力（表1），并且差异显著（P＜0.01）。各菌株在PKO无机磷培养液中有效磷增量在106.63～666.01 mg/L，其中，菌株ls1－3有效磷增量最大，有效磷增量大于 500mg/L 的菌株有 4 株（ls1－3、1s1－5、ls2－13、lhs4），占溶磷细菌总数40%。各菌株在蒙金娜有机磷培养液中的有效磷增量在0.32～58.42mg/L，其中，菌株lhs11有效磷增量（58.42mg/L）最大，菌株lhs4有效磷增量（35.08mg/L）次之，有效磷增量小于3mg/L的菌株有4株（ls2－11、1s2－13、ls2－16、ls3－2），并有2株菌株（ls1－3、1s1－5）不表现溶磷有机磷的能力。各菌株对不同磷源的分解能力均不同，菌株lhs11既能溶解无机磷（PKO培养液的有效磷增量为179.11 mg/L），又能溶解有机磷（蒙金娜培养液的有效磷增量为58.42mg/L），但溶磷的能力差异较大；菌株ls2－13溶解无机磷（PKO培养液的有效磷增量为593.52 mg/L）的能力较强，但溶解有机磷（蒙金娜培养液的有效磷增量为0.46mg/L）的能力较弱；菌株ls1－3溶解无机磷（PKO培养液的有效磷增量为666.01mg/L）的能力很强，但无溶解有机磷的能力。

表1 各菌株在PKO无机磷和蒙金娜有机磷培养液中的有效磷增量Table 1 Available phosphorus increased on PKO and MENG Jin－na culture medium

2.2 分泌IAA能力测定

各菌株用King培养基摇床培养12d，定性和定量测定各菌株IAA的能力，结果表明，各菌株IAA的能力和数量差异显著（P＜0.01）（表2）。测试菌株中7个菌株具有IAA的能力，占供试菌株数的70%，分泌量在0.36～20.39mg/L，其中ls3－5分泌能力最强，分泌量（20.39μg/mL）也最大。而菌株ls2－16，ls3－2和ls2－11均无分泌IAA的能力。定性测定中，若显色反应颜色越深，说明菌株分泌IAA能力越强，反之越弱；若无颜色反应，说明这些菌株没有分泌IAA能力。为进一步确定各菌株分泌IAA的能力，又进行了S2法比色定量测定，测定的结果与定性测定结果一致。

表2 溶磷菌King培养基中分泌IAA量Table 2 Concentration of IAA secreted by phosphatesolubilizing bacteria in King culture medium

3 讨论

植物根际存在很多种溶磷菌，但各菌株的溶磷能力有较大的差异。尹瑞林［24］从土壤中分离出的265株细菌的溶磷能力平均为每克土壤溶磷2～30mg，其中，巨大芽孢杆菌、节细菌、黄杆菌、欧文氏菌及假单胞菌的溶磷能力较强，其次为产碱菌、多黏芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。Sundara等［25］利用磷酸三钙为磷源，经过14d的培养后发现芽孢杆菌和埃希氏菌的溶磷能力较强。随后，Paul和Sundara［26］进一步测定从豆科植物根际分离出来的12种芽孢杆菌溶解磷酸三钙的能力，发现虽然是相同属的细菌，但是Bacillus meaateriu的溶磷能力明显高于Bacillus brevise。林启美等［27］测定假单胞菌属培养7d时溶磷圈D/d值1.00～3.50；芽孢杆菌属培养7d溶磷圈的D/d值1.14～1.43；另外，发现以磷矿粉为唯一磷源培养解磷细菌，5d后培养液中可溶性磷的含量最高为117.3mg/L。冯瑞章等［28］测定定西苜蓿根际溶磷细菌菌株Dm84培养8d后，有效磷增量为227.1mg/L。Kobus［29］研究认为菌株D/d值的变化不仅与时间有关系，还与菌株代谢物种类、释放快慢及代谢产物在培养基上的蔓延程度等有关。此次研究测定供试菌株的溶磷能力差异较大，在PKO无机磷培养基上，各菌株的D/d值在1.07～1.52；在蒙金娜有机磷培养基上，各菌株的D/d值在1.00～1.45。各菌株在PKO无机磷培养液中的有效磷增量在106.63～666.01mg/L，菌株ls1－3有效磷增量最大；各菌株在蒙金娜有机磷培养液中的有效磷增量在0.32～58.42mg/L，其中，菌株lhs11有效磷增量最大。各菌株对不同磷源的分解能力均不同，菌株lhs11既能溶解无机磷，又能溶解有机磷，但溶磷的能力差异较大；菌株ls2－13溶解无机磷的能力较强，但溶解有机磷的能力较弱；菌株ls1－3溶解无机磷的能力很强，但无溶解有机磷的能力。溶磷能力首先取决于菌株本身的特性，另外，菌株的溶磷机理也非常复杂［30－32］，如分泌质子、有机酸和其他物质的数量和种类，其次，与难溶性磷酸盐的结构和组成成分有关系，本研究各菌株的溶磷机理有待进一步研究。

植物根际的很多菌株都具有分泌植物生长激素（IAA）能力［33，34］，分泌量差异较大。Malik等［35］用比色法测定了巴基斯坦盐碱地小麦等植物根际固氮菌株分泌IAA能力，其在5.11～35.70mg/L。本研究各菌株IAA能力进行定性和定量测定结果一致，各菌株分泌IAA量在0.36～20.39mg/L，略低于 Malik的测定结果。出现这种现象的原因可能与菌株种类、生理和生态特性及培养条件等因素有关。比色法只是初步定量研究菌株分泌IAA范围，若要准确反映各菌株分泌IAA含量，需进一步测定。

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