小黄鱼免疫肽制备条件的响应面优化

何佳易，徐 鑫,*，刘国艳，蔡丽丽，魏晓蕊，满其琪，卢正竹

(1.扬州大学食品科学与工程学院，江苏 扬州 225127；2.连云港正荣食品添加剂厂，江苏 连云港 222000)

小黄鱼免疫肽制备条件的响应面优化

何佳易1，徐 鑫1,*，刘国艳1，蔡丽丽1，魏晓蕊1，满其琪1，卢正竹2

(1.扬州大学食品科学与工程学院，江苏 扬州 225127；2.连云港正荣食品添加剂厂，江苏 连云港 222000)

优化胰蛋白酶(PTN 6.0S)酶解小黄鱼制备免疫肽的制备条件。MTT法检测酶解产物对小鼠脾细胞的增殖程度，并以脾细胞增殖指数(SI)为指标，通过单因素试验及响应曲面法优化酶解条件。结果显示：在温度41.66℃、时间18.24h、底物质量浓度6g/100mL、酶与底物的质量比(酶底比)3.13‰条件下，模拟得出多肽产物的SI值为0.387。验证实验发现，在温度42℃、时间18.2h、底物质量浓度6g/100mL、酶底比3‰条件下，SI值为0.369± 0.003，略低于模拟值，所得条件较为理想。

小黄鱼；免疫肽；响应曲面法；MTT法

小黄鱼在我国海域有着广泛的分布，属大宗型海洋鱼资源，产量高，但开发利用率较低，主要为罐头等初级加工类产品，深加工产品规模与其产量有着巨大的差距，其作为蛋白来源用于制备生物活性肽的研究尚未见报道。

近40年来，免疫肽因具有与内源肽相类似的信号传导作用[1-3]，已成为提高机体免疫力研究领域的热点[4-6]。由于活性肽段“隐含”在蛋白质的氨基酸序列中，目前主要采用酶解技术进行制备。该方法受酶种类、底物及酶反应条件等诸多因素影响[7]，所以，研究并控制酶法制备的工艺条件尤为重要。

胰蛋白酶是酶法制肽的常用酶制剂之一，一定程度上可模拟食物在肠道的消化分解过程，更重要的是，该酶水解多种食源蛋白均能得到不同活性的免疫肽。首例免疫肽(六肽)即由人乳蛋白经胰蛋白酶水解制得[8]；而该酶的专一特性也利于获得理想的目标产物，如酪蛋白酶解产物中的酪蛋白磷酸肽[9]。所以，综合考虑后，本实验选取胰蛋白酶(PTN6.0S)为工具酶。

本实验以脱脂酶解产物的脾细胞增殖指数(stimulating index，SI)值为指标，经单因素试验及响应曲面法，分析并优化免疫肽的制备条件。以期对于规模化酶法制备免疫活性肽工艺条件的选择具有一定参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小黄鱼(蛋白质含量约20%)，购自连云港市连云区农贸市场。

ICR小鼠，5～6周龄，扬州大学医学比较中心。

胰蛋白酶PTN6.0S(1.89×104U/g) 丹麦诺维信公司；RPMI-1640粉末、含谷氨酰胺 美国Gibco公司；D-Hank,s洗液、青霉素、链霉素混合液 生工生物工程(上海)有限公司；小牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司；ConA、HEPES、MTT、台盼兰粉末 美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

524型恒温磁力搅拌器 上海梅颖浦公司；RV10 Basic旋转蒸发仪 德国Ika公司；5804R高速离心机 德国Eppendorf公司；Delta320 pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；Alpha1-2 LD Plus冷冻干燥仪 德国Christ公司；ZHJH-C2112B超净工作台 上海智城分析仪器制造有限公司；96孔细胞培养板 美国Costa公司；Ex-800酶标仪 美国Bio-Tek公司；HF90二氧化碳培养箱 德国贺利氏公司；DM2000显微镜 德国莱卡公司。

1.3 方法

1.3.1 多肽样品制备工艺

清洗小黄鱼→去除内脏→绞肉成糜→双蒸水混匀→加酶→恒温酶解→灭酶(沸水浴，10min)→离心(10000r/min，4℃，15min)→取上清→浓缩→冷冻干燥→冻干粉脱脂→挥干溶剂→脱脂样品

1.3.2 酶解条件的单因素试验设计

1.3.2.1 不同底物质量浓度对细胞增殖活性的影响

将底物质量浓度设为1、2、3、4、5、6、7g/100mL，按酶底比1‰，pH7.0，温度50℃反应8h，测定脾细胞经样品作用后的SI值。

1.3.2.2 不同pH值对细胞增殖活性的影响

将pH值设为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，按底物质量浓度3g/100mL，酶底比1‰，温度50℃反应8h，测定脾细胞经样品作用后的SI值。

1.3.2.3 不同温度对细胞增殖活性的影响

将温度设为35、40、45、50、55、60、65℃，按底物质量浓度3g/100mL，酶底比1‰，pH7.0反应8h，测定脾细胞经样品作用后的SI值。

1.3.2.4 不同酶底比对细胞增殖活性的影响

将酶底比设为0.1‰、0.2‰、0.4‰、1‰、2‰、4‰、10‰，按底物质量浓度3g/100mL，pH7.0，温度50℃反应8h，测定脾细胞经样品作用后的SI值。

1.3.2.5 不同时间对细胞增殖活性的影响

将时间设为3、8、13、18、23、28、33h，按底物质量浓度3g/100mL，酶底比1‰，pH7.0，温度50℃反应，测定脾细胞经样品作用后的SI值。

1.3.3 酶解工艺条件的响应曲面试验设计

根据Box-Behnken设计原理，以细胞刺激指数(SI)为响应值，选取温度、时间、底物质量浓度、酶底比为影响因素，进行四因素三水平分析，共29个试验点，其中5个为中心点。

表1 响应面分析试验设计表Table 1 Coded values and corresponding real values of the optimization parameters used in response surface analysis

1.3.4 脾细胞增殖活性测定[10-13]

采用MTT法，并对其进行一定改良后用于实验。无菌获取小鼠脾细胞，活细胞比例保证在95%以上，调整浓度至2×106个/mL，在96孔板中设空白组、对照组和样品组，3组分别为细胞溶液、细胞+ConA溶液、细胞+ConA+样品溶液，各组均设3个平行，置于含5%CO2，37℃的培养箱，终止培养前4h加入适量无菌MTT溶液，继续孵育至结束。取出培养板，充分离心后，弃上清，加入HCl-异丙醇溶液充分溶解结晶，离心取上清，于490nm波长处测其OD值。细胞增殖活性以刺激指数(SI)表示。

1.4 数据处理

实验各值均为3个平行数据的均值，响应曲面试验数据采用Design Expert 7.0软件绘图并作方差和显著性分析等。

2 结果与分析

2.1 单因素试验样品的细胞增殖活性

检测样品免疫活性时，以ConA组刺激指数SI为阳性对照，SI值为0.096±0.0038。

2.1.1 不同底物质量浓度对细胞增殖活性的影响

图1 不同底物质量浓度对SI值的影响Fig.1 Effect of substrate concentration on SI value of small yellow croaker hydrolysate

由图1可知，底物质量浓度在1～4g/100mL时，SI值明显上升，但4g/100mL时的上升幅度有所减小；当质量浓度大于4g/100mL时，SI值开始下降。有学者报道，酶解程度与底物质量浓度呈正相关[14]，即可被蛋白酶切断的肽键数目是酶解工艺的主要影响因素。增加底物质量浓度，即增加酶的初始敏感肽键数目，延缓了免疫活性肽段的释放。

2.1.2 不同pH值对细胞增殖活性的影响

图2 不同pH值对SI值的影响Fig.2 Effect of pH on SI value of small yellow croaker hydrolysate

由图2可知，pH6.0～7.0时，SI值上升，pH值继续增大，SI值明显降低。蛋白质对pH值的变化较为敏感，可能与pH值影响酶活性部位和底物蛋白的解离有关，抑制了活性多肽的释放[15]。林伟峰[7]学者在可控酶解鱼蛋白的研究中发现，pH值恒定利于提高肽得率，有必要寻找工艺中酶的较适pH值。当pH值为7.0时，SI值明显最大，所以，在响应曲面试验中，pH值将恒定在7.0。另外，在细胞培养过程中，培养液的pH值对细胞活力有一定影响[16]，所以，为寻找酶解工艺中更适pH值，今后的实验中尝试在冷冻干燥前将酶解液调至pH7.0，以防对细胞活力的影响。

2.1.3 不同酶解温度对细胞增殖活性的影响

图3 不同酶解温度对SI值的影响Fig.3 Effect of hydrolysis temperature on SI value of small yellow croaker hydrolysate

由图3可知， 45℃和50℃时，酶解产物具有较强的细胞增殖活性。40℃时，利于酶的激活，SI值明显上升。55℃时，SI值有所下降，但根据诺维信公司提供的产品资料显示，此温度为胰蛋白酶(PTN 6.0S)的最适温度。由此表明，选择酶解工艺的温度时，不仅要考虑酶的最适温度，还要考虑产物活性。

2.1.4 不同酶底比对细胞增殖活性的影响

图4 不同酶底比对SI值的影响Fig.4 Effect of enzyme-to-substrate ratio on SI value of small yellow croaker hydrolysate

由图4可知，酶底比在0.1‰～2‰时，酶解产物的细胞增殖活性随酶用量的提高而增强，且增幅明显；继续提高酶用量，SI值下降。在此酶解过程中，氨基氮含量却随酶用量的增加而增加(数据未给出)，这也提示，敏感肽键的减少易使活性多肽被再次分解，从而失去细胞增殖能力。所以，有待增加酶解程度，验证这一猜测。

2.1.5 不同酶解时间对细胞增殖活性的影响

图5 不同酶解时间对SI值的影响Fig.5 Effect of hydrolysis duration on SI value of small yellow croaker hydrolysate

由图5可知，在底物质量浓度一定的情况下，随着时间的延长，并未相应提高酶解产物的细胞增殖活性，18h后，SI值明显下降。由此表明，底物的酶解程度与产物的细胞增殖活性并未始终呈正相关，这可能与活性多肽被进一步水解，或多肽与底物蛋白的竞争性抑制[7]有关。

2.2 响应曲面试验结果与优化

2.2.1 响应曲面试验结果

表2 响应曲面法优化酶解条件的试验设计与结果(χˉ±s,n＝3)Table 2 Experimental design and results of RSM tests(χˉ±s,n＝3)

响应曲面法的试验设计及响应值结果如表2所示。Design Expert 7.0软件分析刺激指数SI回归模型的显著性。结果显示，模型的F值为7.67，P值为0.0002＜0.05，表明该回归模型显著。失拟项的P值达0.9382，说明失拟不显著，信噪比为9.425＞4，说明此模型有较好的拟合度。根据回归系数，可得二次多项回归方程：SI＝ˉ1.96361＋0.074024A＋0.024035B＋0.18378Cˉ 0.012220Dˉ0.000136019ABˉ0.00332551AC＋0.00059305AD＋0.00234502BCˉ0.000115174BDˉ 0.00110592CDˉ0.000641348A2ˉ0.000899122B2ˉ 0.00545785C2ˉ0.0012695D2。回归系数的显著性分析结果显示，一阶主效应中的A项(P＝0.0096)，交互作用中的AC项(P＝0.0002)、BC项(P＝0.0145)，纯二次项中的A2项(P＜0.0001)、B2项(P＜0.0001)、D2项(P＝0.029)均为显著项，影响了响应曲面的弯曲性。

2.2.2 响应曲面分析与条件优化

图6 温度、时间、底物质量浓度、酶底比交互影响SI值的响应曲面和等高线图Fig.6 Response surface and contour plots showing the effects of hydrolysis temperature, duration, substrate mass concentration and enzyme-to-substrate ratio on SI value of small yellow croaker hydrolysate

模型的响应曲面如图6所示，6组图直观反映了各因素间的交互作用。由曲面的弯曲程度和等高线的封闭情况可以看出，图6a、c、e、f的稳定点均落在实验范围里，说明最优点的位置基本就在此范围。图6a所示，温度一定时，随着酶解时间的延长，SI值先升高后下降；时间一定时，SI值随温度的升高而下降。同样，分析其余3组图，SI值的变化趋势与单因素结果相符，结合方程中交互项的显著性分析，表明温度与时间、温度与酶底比、时间与酶底比、底物质量浓度与酶底比的交互作用不明显。

图6b、d的曲面变化趋势不完全符合单因素试验。图6b显示，温度较低时，SI值随着底物质量浓度的增加而上升，温度较高时，SI值却随底物质量浓度的增加而下降，同样，在不同底物质量浓度的情况下，SI值随温度的变化也不同；图6d显示，酶解时间较短时，SI值随底物质量浓度的增加而降低，时间较长时，SI值与底物质量浓度呈正相关，另外，等高线分布显示，不同底物质量浓度情况下，SI值出现极值的时间也不同。由此证明，温度与底物质量浓度、时间与底物质量浓度的交互作用明显，即一方对响应值的影响受另一方制约。软件对试验的优化结果为：温度41.66℃、时间18.24h、底物质量浓度6g/100mL、酶底比3.13‰，多肽产物的SI值为0.387。采用优化的条件对酶解小黄鱼进行重复性实验，为方便操作，条件设为温度42℃、时间18.2h、底物质量浓度6g/100mL、酶底比3‰。结果发现，刺激指数SI为0.369±0.003，与模型估计值0.374相比，相对误差为0.013。

3 结论与讨论

实验结果表明，小黄鱼免疫肽的酶法制备最优工艺为底物质量浓度6g/100mL、pH7.0、温度42℃、酶底比3‰、时间18.2h，其中，底物质量浓度与温度、时间的交互作用显著。此结论为进一步研究小黄鱼免疫肽的制备工艺提供了参考。

本研究探讨免疫肽的制备工艺，其实质就是酶反应条件对产物活性成分的影响。蛋白酶解的机制普遍复杂，产物成分较多，主要受底物和酶的影响。实验选用胰蛋白酶，其作用位点少，价格适中，且能酶切获得免疫活性肽，属酶解工艺中的实用酶制剂。结果分析显示，小黄鱼为底物蛋白，底物质量浓度仍然是酶反应的主要影响因素。这与Guerard等[17]学者关于底物与酶反应的报道相符，说明底物中的敏感肽键及有潜力被切断的肽键是控制酶反应进程的主要因素，同时也解释了不同酶反应阶段的产物成分差异性，继而影响多肽产物的免疫活性。结合其他因素，分析交互作用可知，温度、时间对底物质量浓度控制酶反应进程的影响显著，这可能与酶活力的改变有关。总之，在酶法制备生物活性多肽的过程中，不再追求高水解度，应以获得目标多肽为宗旨，继而提高酶解效率，实现较好的经济效益。

本实验在制备多肽过程中，未先对小黄鱼进行脱脂，旨在为后期探索蛋白质与脂肪的综合利用做基础。然而，随机抽取数组未脱脂样品，考察其免疫活性，结果发现，SI值明显比同等浓度的脱脂样品小(数据未给出)，主要原因是脂肪酸及其氧化产生的自由基抑制细胞生长。该发现与潘妹霞[18]、王彩云[19]、夏延平[20]等的报道相符合，以期为相关方面的研究提供借鉴。

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Optimization of Hydrolysis Conditions for Production of Immune Peptides from Small Yellow Croaker Using Response Surface Methodology

HE Jia-yi1，XU Xin1,*，LIU Guo-yan1，CAI Li-li1，WEI Xiao-rui1，MAN Qi-qi1，LU Zheng-zhu2
(1. College of Food Science and Engineering, Yangzhou University, Yangzhou 225127, China；2. Lianyungang Zhengrong Food Additive Factory, Lianyungang 222000, China)

Objective: To optimize process conditions for the hydrolysis of small yellow croaker by trypsin (PTN 6.0S) to prepare peptides with high immuno-activity. Methods: the proliferative effect (expressed as stimulation index, SI) of small yellow croaker hydrolysate on mouse spleen cells was assessed by the MTT assay. Based on the index, single-factor experiments followed by response surface analysis were carried out for the optimization of hydrolysis conditions. Results: The optimal hydrolysis conditions for preparing immune peptides were hydrolysis at 41.66 ℃ for 18.24 h at a substrate concentration of 6 g/100 mL and an enzyme-to-substrate mass ratio of 3.13‰. Under these conditions, the predicted SI of small yellow croaker hydrolysate was 0.387. When the temperature, time and substrate concentration were modified as 42 ℃, 18.2 h and 3‰, the actual SI was 0.369± 0.003, which was slightly lower than the predicted value. Thus, appropriate process conditions were achieved.

small yellow croaker；immune peptides；response surface methodology；MTT assay

TS218

A

1002-6630(2012)03-0151-06

2011-05-03

江苏省科技型中小企业技术创新资金项目(BN2008207)

何佳易(1987—)，女，硕士研究生，研究方向为功能性食品资源开发与利用。E-mail：yzu.hejiayi@163.com

*通信作者：徐鑫(1977—)，男，副教授，博士，研究方向为功能性食品资源开发与利用。E-mail：xuxin@yzu.edu.cn