液体培养的桑黄胞外多糖发酵培养基成分的优化

邵 杰，罗建光，曾晓雄,*

(1.南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095；2.蚌埠学院生物与食品工程系，安徽 蚌埠 233000)

液体培养的桑黄胞外多糖发酵培养基成分的优化

邵 杰1,2，罗建光1，曾晓雄1,*

(1.南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095；2.蚌埠学院生物与食品工程系，安徽 蚌埠 233000)

通过27-3IV部分因子设计(FFD)，对葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氢钾、硫酸镁、VB1以及草酸铵7个营养因子进行筛选。在此基础上，采用中心组合设计对部分因子设计，筛选出对桑黄胞外多糖产量的关键因子，确定培养基的

鲍氏层孔菌；胞外多糖；部分因子设计；中心组合设计

鲍氏层孔菌(Phellinus baumii Pilát)是重要的药用真菌，其子实体俗称桑黄。桑黄多糖是桑黄的主要药效成分之一，具有提高机体免疫力、抑制肿瘤、降血糖、抗糖尿病等多方面的生物活性和药理作用[1-7]。

传统上，鲍氏层孔菌的活性成分多糖通常从子实体中提取；但由于鲍氏层孔菌野生资源(子实体)的日益匮乏，加之人工栽培周期长、难度较大，这已限制了对桑黄的进一步开发和利用。而液体深层发酵具有周期短、多糖产量高、条件控制容易、污染少、便于发酵下游加工处理以及工业化大规模生产等特点，是大量获取活性多糖的理想途径，因而通过液体发酵制备桑黄多糖备受关注[8-11]。然而，培养条件是液体发酵成功与否的关键因素。目前尚没有关于采用数理统计方法优化鲍氏层孔菌胞外多糖培养条件的报道。为此，本研究采用部分因子设计(FFD)和响应曲面中的中心组合设计(CCD)，以桑黄胞外多糖产量为指标，对鲍氏层孔菌的培养条件进行优化，以期筛选出能高产鲍氏层孔菌多糖的培养基成分，为进一步开发鲍氏层孔菌资源提供依据和理论基础。

1 材料与方法

1.1 菌株与培养基

鲍氏层孔菌(P.baumii Pilát)购自中国林业微生物菌种保藏管理中心。

斜面培养基：综合PDA培养基；种子培养基(g/L)：葡萄糖20、蛋白胨2、酵母膏1、KH2PO41、MgSO40.5、VB10.01，pH6.0；发酵培养基：按照实验设计配制。

1.2 菌种培养及接种

取活化后的斜面试管菌种接入盛有100mL种子培养基的500mL三角瓶中，按照实验设计，采用不同的培养基在温度为28℃、pH值为6.0以及培养时间为5d的条件下，置往复式摇床中进行培养。

1.3 胞外多糖的制备

培养结束后，不同发酵条件下的发酵醪液在5000r/min进行离心20min，上清液经滤纸过滤后，浓缩至原体积的1/3，在4℃条件下用75%乙醇沉淀、过夜，经离心得到的沉淀分别用无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤两次、干燥，得到桑黄胞外粗多糖[12]。采用苯酚-硫酸法测定胞外总糖含量。采用DNS法(3,5-二硝基水杨酸法)测定还原糖含量。桑黄多糖的产量以每升发酵醪液中胞外多糖(EPS)的干质量进行计算，单位为g/L。

胞外多糖含量=胞外总糖含量ˉ胞外还原糖含量

1.4 培养基优化设计

根据药用真菌生长所需营养要素的基本原则以及药用真菌发酵影响因素的一般规律，结合近期的相关文献报道[13-14]以及前期单因素试验，选取葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氢钾、硫酸镁、VB1以及草酸铵7个营养因子进行考察，其优化步骤包括两个阶段：1)通过27-3IV部分因素设计(FFD)，对7个变量进行筛选，确定影响桑黄胞外多糖产量的关键因素；2)采用响应曲面设计中的中心组合设计对部分因素设计筛选出的有显著影响胞外多糖产量的因素水平进行优化，最终确定培养基的组成和水平。采用Stat-Ease Design-Expert软件(version7.1.3, Stat-Ease Corporation, USA)和SAS statistical package (Version 8.1, SAS Institute Inc., NC, USA)进行试验设计、数据分析及模型的建立。

1.4.1 部分因子设计

选取葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氢钾、硫酸镁、VB1以及草酸铵(C2H8N2O4)7个营养因子及其编码水平设计见表1。

表1 27-3IV部分因子试验设计因素编码及水平Table 1 Coded and real values of the variables tested in 27-3IV fractional factorial design

1.4.2 中心组合设计

通过27-3IV部分因子设计，发现葡萄糖、酵母膏和草酸铵是影响桑黄胞外多糖产量的关键因素。采用全因素中心组合试验设计对影响桑黄胞外多糖产量的培养基关键组成成分及其最佳水平进行探索。

2 结果与分析

2.1 部分因子设计及关键因子的确定

27-3IV部分因子设计见表2，包括16个试验点和4个重复的中心点，在发酵培养6d、pH6.0、培养温度28℃的条件下，测定其响应值桑黄胞外多糖产量。

表2 部分因子试验设计及结果(n＝2)Table 2 27-3IV fractional factorial design and experiments results(n＝2)

在前期实验工作的基础上，选取葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸二氢钾、硫酸镁、VB1以及草酸铵7个营养因子进行主因素分析。从表2可以看出，在不同的培养基成组合情况下，胞外多糖产量在0.59～2.38g/L之间变化。

表3 部分因子设计试验结果的统计分析Table 3 Statistical analysis of the experimental results of 27-3IV fractional factorial design

对试验结果进行方差分析(表3)，所选用的模型具有高度的显著性(P=0.0314)，其校正相关系数R2=90.28%，表明此模型拟合度较好，所研究的7个因子仅有9.72%的桑黄胞外多糖产量总变异不能够用此模型来解释，表明该模型适合解释和预测桑黄胞外多糖产量。该模型回归系数显著性检验表明葡萄糖(P=0.0111)、酵母膏(P=0.0381)、草酸铵(P=0.0115)、葡萄糖与酵母膏(P=0.0498)、葡萄糖与草酸铵(P=0.0179)、葡萄糖、蛋白胨与磷酸二氢钾(P=0.0107)的交互作用对桑黄胞外多糖产量有显著影响。因此，葡萄糖、酵母膏和草酸铵3个培养基成分被确定为影响桑黄胞外多糖产量的关键因素。

2.2 中心组合设计及响应面分析

根据部分因子设计的试验结果，在中心组合设计试验中，3个关键因素代码及其中心点分别为葡萄糖(X1) 30g/L、酵母膏(X2) 4.5g/L、草酸铵(X3) 1.0g/L，而蛋白胨、硫酸镁、KH2PO4和VB1等4个因素在FFD试验统计分析中，在5%置信度上没有显著性，作为常量对待，取中间水平值分别为4、0.75、1g/L和0.0075g/L。

表4 中心组合试验设计及其响应值(n＝2)Table 4 Central composite experimental design and results(n＝2)

表4列出三因素五水平的中心组合试验设计及其响应值，包括20个试验点和6个重复的中心点，发酵培养6d、pH值为6.0，培养温度为28℃。表中自变量编码方程为：χi=(XiˉX0)/ΔXi，式中χi为自变量编码值，Xi为自变量水平实际值，X0为实验水平中心点实际值，ΔXi表示各变量实际值与中心点值之差。运用Design Experts 7.1.3软件和SAS软件对实验数据进行回归分析，根据以式(1)拟合出二次多元回归模型：

式中：Y为鲍氏层孔菌胞外多糖产量；β0、βi、βii、 βij分别表示常数项、一次项、二次项和交互项的系数；Xi、Xj表示两个不同的变量(i≠j)。模型方程的拟合性质由决定系数R2及方差分析判定，统计显著性和回归系数显著性进行F检验来检测，P值取0.05、0.01两个不同水平。

根据CCD试验设计原理，利用Design Expert 7.1.3软件对试验数据进行二次多元回归拟合，以Y代表桑黄胞外多糖产量为响应值，回归方程为：

由表5可见，该回归模型(P=0.0024)高度显著，失拟项(P=0.3507)不显著，表明该模型适合解释和预测桑黄胞外多糖产量；而且模型的一次项(X1、X2、X3)、平方项(X12、X22、X32) 和交互项(X1X3)是显著的。其校正相关系数R2=0.7458，说明由这3个因子及其二次项能解释桑黄胞外多糖产量总变异的74.58%，模型拟合程度较好，可以利用该回归方程确定最优的产桑黄胞外多糖的培养基成分。

表5 多元回归模型方差分析表Table 5 Variance analysis for the established regression model

通过桑黄胞外多糖产量回归模型方程所作的响应曲面图及其等高线图见图1～3，通过该组图即可直观地评价出因素对桑黄胞外多糖产量影响的两两交互作用以及确定各个因素的最佳水平范围。

图1 葡萄糖和酵母膏交互影响EPS产量的响应曲面和等高线图Fig.1 3D response surface and contour plots showing the interactive effects of glucose and yeast extract concentrations on EPS production (C2H8N2O4 concentration = 1 g/L)

图1 显示了草酸铵质量浓度1g/L时，葡萄糖和酵母膏对桑黄胞外多糖产量的效应。葡萄糖既是菌体生长的碳源和能源，同时又是产物EPS重要组成成分。葡萄糖在培养基中具有重要作用，其质量浓度的变化直接影响EPS产量。当培养基中葡萄糖质量浓度较高时，胞外多糖产量随着酵母膏质量浓度的增加而降低，这可能是由于较高质量浓度碳氮源导致太高的渗透压，不利于菌体生长有关；而在低质量浓度时，EPS产量随着酵母膏质量浓度的增加而增加。此外，等高线图的形状直接反应交互作用的强弱[15]。从葡萄糖和酵母膏交互作用的等高线图c可以看出，二者之间存在一定的交互作用，但在P = 0.05水平上没有差异显著性。

当酵母膏4.5g/L时，葡萄糖和草酸铵对桑黄胞外多糖产量的交互作用影响的响应曲面和等高线图见图2。在低水平的葡萄糖质量浓度时(20～30g/L)，EPS产量随草酸铵质量浓度的增加而增加；高水平的葡萄糖质量浓度时(30～40g/L)，EPS产量随草酸铵质量浓度的增加而降低。葡萄糖和草酸铵交互作用的等高线图呈椭园形，具有较强的交互影响。同时，高质量浓度的碳氮源增加了培养基的渗透压，造成菌体生长迟缓或停滞，进而降低了EPS产量。

图2 葡萄糖和草酸铵交互影响EPS产量的响应曲面和等高线图Fig.2 3D response surface and contour plots showing the interactive effects of glucose and C2H8N2O4 concentrations on EPS production ( yeast extract concentration = 4 g/L)

葡萄糖的质量浓度处于40g/L时，酵母膏和草酸铵对桑黄胞外多糖产量的交互作用影响的响应曲面图和等高线见图3。氮是构成重要生命物质蛋白质和核酸等的主要元素，是微生物生长繁殖所需的主要营养物。前期的研究发现酵母膏和草酸铵分别是产胞外多糖的鲍氏层孔菌液体发酵重要有机氮源和无机氮源。由图3可见，酵母膏的质量浓度处于低水平时(3.0～4.5g/L)，胞外多糖产量随着草酸铵的质量浓度增加而增加。当酵母膏的质量浓度处于较高水平时(4.5～6.0g/L)，随着草酸铵的质量浓度增加，胞外多糖产量反而下降。这可能与酵母膏营养成分复杂、酵母膏与草酸铵的浓度过高，培养基组成的C/N比过低，培养基的渗透压过高，造成菌体对氮源利用程度下降，不利于菌体生长代谢，从而导致胞外多糖产量降低。此外，酵母膏和草酸铵交互作用的等高线图亦呈椭圆形，也具有较强的交互影响。

图3 酵母膏和C2H8N2O4交互影响EPS产量的响应曲面和等高线图Fig.3 3D response surface and contour plots showing the interactive effects of yeast extract and C2H8N2O4 concentrations on EPS production (glucose concentration = 30 g/L)

由图1～3可知，3个响应曲面图均存在极值点，对二次多元回归方程(2)求极大值，即得桑黄胞外多糖产量的预测值为2.342g/L。对应的3个因素：葡萄糖、酵母膏和草酸铵的代码值分别为0.41、0.34、ˉ0.23；相应的最佳质量浓度分别为：葡萄糖34.12g/L、酵母膏5.01g/L、草酸铵0.88g/L。

为验证回归模型的可靠性和响应曲面的分析结果，将响应面实验优化得到的培养基在相同的发酵条件下进行5次平行实验，结果发现桑黄胞外多糖平均产量为(2.363 ± 0.04)g/L，与预测值(2.342g/L)吻合度较高。由此可见，用该回归模型优化产胞外多糖的发酵培养基成分是可行的。

应用部分因子设计(FFD)和中心组合试验设计(CCD)方法，优化了鲍氏层孔菌发酵生产胞外多糖的培养基。结果表明，在所选取的7个影响因素中，仅葡萄糖、酵母膏以及草酸铵3个因素的可信度＞95%，是影响胞外多糖产量的关键因素。进一步的响应面分析表明，在上述自变量分别为：葡萄糖34.12g/L、酵母膏5.01g/L、蛋白胨4g/L、MgSO40.75g/L、KH2PO41g/L、VB10.0075g/L、草酸铵0.88g/L时，桑黄胞外多糖产量达到最大值(2.363±0.04)g/L。

3 结 论

本研究首先利用部分因子设计，对影响桑黄胞外多糖产量的诸多相关因子进行了评价，成功的筛选出影响胞外多糖产量的主要影响因素，省时省力，快速有效。通过响应面中的中心组合设计建立了关键影响桑黄胞外多糖产量的二次多项数学模型，并利用统计学方法对该模型进行了显著性检验，优化了因素水平，探讨了各因素间的交互作用。通过对模型方程的3-D图及其等高线图进行研究发现，桑黄胞外多糖平均产量为(2.363 ± 0.04)g/L，与预测值(2.342g/L)吻合度较高。由此可见，将部分因子设计和响应面中的中心组合设计相结合优化微生物发酵条件是一种十分有效的方法。

[1]HWANG H J, KIM S W, LIM J M, et al. Hypoglycemic effect of crude exopolysaccharides produced by a medicinal mushroom Phellinus baumii in streptozotocin-induced diabetic rats[J]. Life Science, 2005, 76(26): 3069-3080.

[2]KIM H M, HAN S B, OH G T, et al. Stimulation of humoral and cell meditated immunity by polysaccharide from mushroom Phellinus linteus [J]. International Journal of Immunopharmacology, 1996, 18(5): 295-303.

[3]KIM H Y, YOON D H, LEE W H, et al. Phellinus linteus inhibits inflammatory mediators by suppressingredox-based NF-κB and MAPKs activation in lipopolysaccharide-induced RAW 264.7 macrophage[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2007, 114(3): 307-315.

[4]池玉杰, 潘学仁. 7种木层孔菌属真菌的培养特性[J]. 菌物系统, 2001, 20(3): 379-380.

[5]国家卫生部和国家中医药管理局. 中华本草: 第一卷[M]. 上海: 上海科学技术出版社, 1999.

[6]骆冬青, 郑红鹰, 汪维云. 珍稀药用真菌桑黄的研究进展[J]. 药物生物技术, 2008, 15(1): 76-78.

[7]戴玉成. 药用担子菌: 鲍氏层孔菌(桑黄)的新认识[J]. 中草药, 2003, 34(1): 94.

[8]CHO Y J, HWANG H J, KIM S W, et al. Effect of carbon source and aeration rate on broth rheology and fungal morphology during red pigment production by Paecilomyces sinclairri in a batch bioreactor[J]. Journal of Biotechnology, 2002, 95: 13-23.

[9]PARK J P, KIM Y M, KIM S W, et al. Effect of aeration rate on the mycelial morphology and exo-biopolymer production in Cordyceps militaris[J]. Process Biochemistry, 2002, 37(11): 1257-1262.

[10]SINHA J, BAE J T, PARK J P, et al. Changes in morphology of Paecilomyces japonica and its effect on broth rheology during production of exo-biopolymers [J]. Applied Microbiol Biotechnology, 2001, 56(1/2): 88-92.

[11]LEE B C, BAE J T, PYO H B, et al. Submerged culture conditions for the production of mycelial biomass and exopolysaccharides by the edible Basidiomycete Grifola frondosa[J]. Enzyme and Microbial Technology, 2004, 35(5): 369-376.

[12]YANG Xiaotong, WAN J M F, MI Ke, et al. The quantification of (1,3)-β-glucan in edible and medicinal mushroom polysaccharides by using limulus G test[J]. Mycosystema, 2003, 2: 296-302.

[13]CHEN Wei, ZHAO Zhao, CHEN Shifen, et al. Optimization for the production of exopolysaccharide from Fomes fomentarius in submerged culture and its antitumor effect in vitro[J]. Bioresource Technology, 2008, 99(8): 3187-3194.

[14]MAO X B, EKSRIWONG T, CHAUVATCHARIN S, et al. Optimization of carbon source and carbon/nitrogen ratio for cordycepin production by submerged cultivation of medicinal mushroom Cordyceps militaris [J]. Process Biochemistry, 2005, 40(5): 1667-1672.

[15]MURALIDHAR R V, CHIRUMAMILA R R, MARCHANT R, et al. A response surface approach for the comparison of lipase production by Candida cylindracea using two different carbon sources[J]. Biochemical Engineering Journal, 2001, 9(1): 17-23.

Optimization of Cultivation Conditions for Extracellular Polysaccharide Production by P. baumii Pilát

SHAO Jie1,2，LUO Jian-guang1，ZENG Xiao-xiong1,*
(1. College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China；2. Department of Biotechnology and Food Engineering, Bengbu College, Bengbu 233000, China)

A 27ˉ3IVfractional factorial design (FFD) was employed to determine culture medium ingredients affecting extracellular polysaccharide (EPS) production by P. baumii Pilát, such as glucose, peptone, yeast extract, ammonium oxalate, KH2PO4, MgSO4 and thiamine (VB1). Glucose, yeast extract and ammonium oxalate were identified as key affecting factors, and their optimal levels were further investigated by means of a central composite design. The average EPS yield from 5 parallel fermentation experiments carried out using a culture medium (g/L) composed of glucose 34.12, yeast extract 5.01, peptone 4, MgSO40.75, KH2PO41, VB10.0075 and ammonium oxalate 0.88 was (2.363 ± 0.04)g/L, which was in substantial agreement with the predicted value (2.342 g/L). It can be seen clearly that the developed regression model is applicable for the optimization of culture medium for EPS production.

Phellinus baumii Pilát；extracellular polysaccharide；fractional factorial design；central composite design

TQ920.4

A

1002-6630(2012)03-0121-05

2011-05-01

安徽省教育厅高校自然科学研究项目(KJ2009B076)

邵杰(1968—)，男，讲师，硕士，研究方向为食品微生物与生物技术。E-mail：shaoj9099@163.com

*通信作者：曾晓雄(1964—)，男，教授，博士，研究方向为糖生物学与糖生物工程、酶工程、天然产物化学。E-mail：zengxx@njau.edu.cn

组成和水平。在葡萄糖34.12g/L、酵母膏5.01g/L、蛋白胨4g/L、MgSO40.75g/L、KH2PO41g/L、VB10.0075g/L、草酸铵0.88g/L的条件下进行5次平行发酵实验。结果发现桑黄胞外多糖平均产量为(2.363±0.04)g/L，与预测值(2.342g/L)基本相符。可见，用该回归模型优化产桑黄胞外多糖的发酵培养基是可行的。