壳聚糖固定瑞士乳杆菌蛋白酶的条件研究

王翠翠，郭宇星,*，潘道东,2

(1.南京师范大学金陵女子学院，江苏 南京 210097；2.宁波大学海洋学院，浙江 宁波 315211)

壳聚糖固定瑞士乳杆菌蛋白酶的条件研究

王翠翠1，郭宇星1,*，潘道东1,2

(1.南京师范大学金陵女子学院，江苏 南京 210097；2.宁波大学海洋学院，浙江 宁波 315211)

以壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂，采用交联-吸附法对瑞士乳杆菌蛋白酶的固定化条件进行研究。在单因素试验基础上，以固定化酶活力为主要指标，研究凝结液、壳聚糖质量浓度、酶用量、交联时间、戊二醛质量浓度对瑞士乳杆菌蛋白酶固定化的影响。运用响应面对固定化条件进行优化，确定瑞士乳杆菌蛋白酶的最优固定条件：凝结液为4g/100mL NaOH-甲醇(体积比3:1)、壳聚糖质量浓度2.89g/100mL、酶用量2.95mg、交联时间1h、戊二醛质量浓度0.40g/100mL，此时固定化酶活力为28.67U。

瑞士乳杆菌蛋白酶；固定化；酶活力

近年来研究发现采用某些瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)菌株制作的发酵乳有较强的降高血压功能，主要是因为瑞士乳杆菌的蛋白酶可分解乳蛋白产生多肽，这些多肽对血管紧张素转移酶(angiotensin I-converting enzyme，ACE)[1]具有抑制作用，从而可降低人体血压。血管紧张素转化酶(angiotensin-I converting enzyme，EC3.4.15.1)抑制肽是一类具有抑制ACE活性的肽类物质，这些多肽具有降血压的功能[2]。在瑞士乳杆菌蛋白酶研究方面，Guo Yuxing[3-4]、Yamamoto[5]、Fang[6]、Coolbear[7]等对细胞壁蛋白酶的纯化、反应条件、特异性、生产利用及稳定性等进行了研究。郭宇星等[8]从瑞士乳杆菌ATCC15019发酵乳及其胞内粗提物水解脱脂乳的水解液中分离到具有较强ACE抑制活性和降高血压功能的活性肽Ile-Pro-Pro (IPP)和Val-Pro-Pro (VPP)。

利用瑞士乳杆菌蛋白酶能水解乳蛋白产生ACE抑制肽，但采用游离瑞士乳杆菌蛋白酶存在以下不足之处：酶解产物与蛋白酶分离困难，增加分离提纯成本；蛋白酶稳定性不好，保存不好易失活；蛋白酶不能回收重复利用等。这一系列弊端，会导致ACE抑制肽的生产成本较高，制约ACE抑制肽的大规模生产。所以如果能利用固定化瑞士乳杆菌蛋白酶[9-10]水解乳蛋白，将可以实现ACE抑制肽的大规模生产及工业应用。本研究采用壳聚糖[11]固定化瑞士乳杆菌蛋白酶，并利用响应面法进行固定化条件的优化研究，旨在为ACE抑制肽的大规模生产及工业应用提供基础研究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

瑞士乳杆菌15019(Lactobacillus helveticus 15019) 本实验室保藏菌株；MeOsuc-Arg-Pro-Tyr-pNA (MS-Arg)美国MP Biomedicals公司合成；乙酸、壳聚糖、戊二醛 南京生兴生物技术有限公司；其他试剂均购自上海久亿化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

AVY220电子天平 日本Shimadzu公司；YXQ-LS-50SII高压灭菌锅 西安常仪仪器设备有限公司；LRH-250A恒温培养箱 广东省医疗器械厂；A1301019低温高速离心机、A1801023恒温匀速摇床 上海艾测电子科技有限公司；SL-900D超声波破碎仪 南京顺流仪器有限公司；HH-4数显恒温水浴锅、磁力搅拌器 南京智拓仪器仪表有限公司；HI9124N pH测定仪 上海米联电子科技有限公司；722型可见分光光度计 上海精密科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 瑞士乳杆菌蛋白酶的提取

瑞士乳杆菌菌体冻干粉(ˉ80℃冷藏)接种于MRS培养基，连续活化3代，按3%接种量接种于1L MRS培养基中，37℃扩大培养至生长对数期取出，4℃、4500r/min离心20min收集菌体沉淀。用50mmol/L Tris-HCl(pH7.1)缓冲液洗涤菌体，4℃、4500r/min离心20min，弃上清，重复洗涤3次，收集菌体备用。

采用超声波破碎法提取：准确称取菌体2g，用50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.1)10mL重新悬浮菌体，搅匀，进行超声波破碎，超声波破碎条件为300W、破碎时间3s、间隔时间5s、破碎200次。取破碎液4℃、4500r/min离心20min，取上清液即为粗酶液。

1.3.2 固定化瑞士乳杆菌蛋白酶活力测定

以MeOsuc-Arg-Pro-Tyr-pNA (MS-Arg)为底物，配成16.4mmol/L。取0.05mL底物，1g壳聚糖固定化瑞士乳杆菌蛋白酶小球，2.85mL Tris-HCl缓冲液(50mmol/L，pH7.8)混合，在37℃条件下保温60min。用0.5mL 30%乙酸终止反应，于4℃、4500r/min离心20min，去除固定化小球后，取上清液在410nm波长处测定吸光度。空白对照管：以蒸馏水代替酶液进行同样条件的操作。酶活力定义：37℃时，每小时吸光度上升0.01为一个活力单位(U)。

1.3.3 壳聚糖固定瑞士乳杆菌蛋白酶

取一定量壳聚糖溶解于100mL水，搅拌10min，加1mL乙酸，搅拌3h后，4℃条件下过夜。配成一定质量浓度的壳聚糖溶液，然后用注射器分批加入到凝结液中，使凝结成中空球形壳聚糖，静置3h。取一定量的中空球形壳聚糖，蒸馏水洗涤至中性，放入一定质量浓度的戊二醛水溶液100mL中活化一定时间，再用蒸馏水洗涤至中性，制得经过戊二醛活化的中空球形壳聚糖。分别取一定量的瑞士乳杆菌蛋白酶溶液加入到1g戊二醛活化的中空球形壳聚糖，室温下搅拌反应，于4℃静置固定过夜，Tirs-HCl缓冲液(pH7.1)洗涤数次，除去游离蛋白酶，得到固定化蛋白酶[12]，按照1.3.2节方法测定固定化瑞士乳杆菌蛋白酶的活力。

1.3.4 壳聚糖固定瑞士乳杆菌蛋白酶单因素试验条件研究

1.3.4.1 凝结液的影响

在壳聚糖质量浓度2.5g/100mL、戊二醛质量浓度0.4g/100mL、戊二醛交联时间2h、瑞士乳杆菌蛋白酶用量3mg的条件下，改变凝结液分别为：A液：15g/100mL NaOH-甲醇溶液体积比4:1；B液：4g/100mL NaOH-乙酸乙酯溶液体积比20:1；C液：4g/100mL NaOH-甲醇溶液体积比3:1；D液：20mg/mL三聚磷酸钠，考察其对固定瑞士乳杆菌蛋白酶的影响，实验重复3次[13]。

1.3.4.2 戊二醛质量浓度的影响

在凝结液4g/100mL NaOH-甲醇(体积比3:1)、壳聚糖质量浓度2.5g/100mL、戊二醛交联时间2h、瑞士乳杆菌蛋白酶用量3mg的条件下，改变戊二醛质量浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5g/100mL，考察其对固定瑞士乳杆菌蛋白酶的影响，实验重复3次[14]。

1.3.4.3 壳聚糖质量浓度的影响

在凝结液4g/100mL NaOH-甲醇(体积比3:1)、戊二醛质量浓度0.4g/100mL、戊二醛交联时间2h、瑞士乳杆菌蛋白酶用量3mg的条件下，分别取壳聚糖1.5、2、2.5、3、3.5g，配成质量浓度1.5、2、2.5、3、3.5g/100mL 5种质量浓度的壳聚糖溶液制备壳聚糖小球，考察其对固定瑞士乳杆菌蛋白酶的影响，实验重复3次[15]。

1.3.4.4 戊二醛交联时间的影响

在凝结液4g/100mL NaOH-甲醇(体积比3:1)、壳聚糖质量浓度2.5g/100mL、戊二醛质量浓度0.4g/100mL、瑞士乳杆菌蛋白酶用量3mg的条件下，改变戊二醛交联时间分别为1、2、3、4、5h，考察其对固定瑞士乳杆菌蛋白酶的影响，实验重复3次[16]。

1.3.4.5 酶用量的影响

采用考马斯亮蓝法测瑞士乳杆菌蛋白酶液的蛋白含量，经计算每个反应中加入相应的酶量，使酶用量分别为1、2、3、4、5mg，在凝结液4g/100mL NaOH-甲醇(体积比3:1)、壳聚糖质量浓度2.5g/100mL、戊二醛质量浓度0.4g/100mL、戊二醛交联时间2h的条件下，考察酶用量对固定瑞士乳杆菌蛋白酶的影响，实验重复3次[17]。

1.3.5 壳聚糖固定瑞士乳杆菌蛋白酶响应面分析试验

根据单因素试验结果，采用响应面设计试验，运用Box-Behnken的中心组合试验设计原理。以壳聚糖质量浓度(X1)、酶用量(X2)、交联时间(X3)、戊二醛质量浓度(X4)为变量，展开四因素三水平的响应面试验，试验设计见表1。采用Design-Expert 7.1.3进行方差分析以评价模型的统计意义。

表1 Box-Behnken设计试验Table 1 Coded values and corresponding real values of the optimization parameters tested in Box-Behnken experimental design

2 结果与分析

2.1 壳聚糖凝结液的确定

图1 不同凝结液对固定化蛋白酶活力的影响Fig.1 Effect of condensate on the activity of immobilized enzyme

15g/100mL NaOH-甲醇溶液(A液)：小球成型速度一般，呈规则小球状，微透明纯白色，加戊二醛交联后呈浅黄色；4g/100mL NaOH-乙酸乙酯溶液(B液)：小球成型速度较慢，易黏连，呈微透明纯白色，加戊二醛交联后呈微黄色。4g/100mL NaOH-甲醇溶液(C液)：小球成型速度很快，呈规则小球状，微透明纯白色，加戊二醛交联后呈浅黄色；20mg/mL三聚磷酸钠(D液)：小球成型速度一般，呈规则小球状，不透明纯白色，加戊二醛交联后呈浅褐色，易碎。由图1可知，以4g/100mL NaOH-甲醇溶液(体积比3:1)为壳聚糖凝结液时，固定化蛋白酶的活性最高；从小球凝结状态看出，此条件下小球成型速度很快，呈规则小球状。因此，兼顾固定化蛋白酶活性以及壳聚糖凝结小球的状态，选取4g/100mL NaOH-甲醇溶液(3:1)为壳聚糖小球凝结液。

2.2 戊二醛质量浓度的确定

图2 戊二醛质量浓度对固定化蛋白酶活力的影响Fig.2 Effect of glutaraldehyde concentration on the activity of immobilized enzyme

由图2可知，当戊二醛质量浓度低于0.4g/100mL，随着戊二醛质量浓度的增加，固定化酶活性增加，当戊二醛质量浓度高于0.4g/100mL时，固定化酶活性逐渐减小；当戊二醛质量浓度在0.4g/100mL时，固定化酶活性最高。随着戊二醛质量浓度的缓慢增加，壳聚糖分子中被活化的氨基数量不断增多，大量的酶蛋白被固定到壳聚糖微球上，使得固定化蛋白酶的活性不断增大；当戊二醛质量浓度达到0.4g/100mL时，足以使壳聚糖分子上及酶蛋白上的氨基充分交联，固定化蛋白酶活性达到最大值；但随着戊二醛质量浓度的进一步增大，戊二醛对酶蛋白的变性作用增强，导致酶蛋白变性失活，使固定化蛋白酶活性降低。因此要得到较好的固定化效果，必须控制戊二醛质量浓度适当，本实验确定其质量浓度为0.4g/100mL。

2.3 壳聚糖质量浓度的确定

小球状态：1.5g/100mL壳聚糖溶液，溶液较稀，小球呈半透明白色，颜色很淡；2g/100mL壳聚糖溶液，溶液稀薄度适中，小球呈微透明白色，颜色适中；2.5g/100mL壳聚糖溶液，溶液稀薄度适中，小球呈不透明白色；3g/100mL壳聚糖溶液，溶液较浓，小球呈不透明白色，溶液浓度较高，较难形成小球形状；3.5g/100mL壳聚糖溶液，溶液很浓，小球呈不透明白色，溶液质量浓度很高，几乎无法形成小球。

由图3可知，当壳聚糖质量浓度为2g/100mL时，固定化蛋白酶的活性最高；从小球状态可以看出，使用2g/100mL壳聚糖溶液时，凝结小球易成型。因此，兼顾固定化蛋白酶活性与小球的凝结状态，选取质量浓度为2g/100mL的壳聚糖溶液制作固定化小球。

图3 壳聚糖质量浓度对固定化蛋白酶活力的影响Fig.3 Effect of chitosan concentration on the activity of immobilized enzyme

2.4 戊二醛交联时间的影响

图4 戊二醛交联时间对固定化蛋白酶活力的影响Fig.4 Effect of cross-linking time on the activity of immobilized enzyme

由图4可知，随着交联时间的延长，固定化蛋白酶活性由小变大，当交联时间为3h，固定化蛋白酶活性最大，达到24.7U。3h后，随着交联时间的不断延长，固定化蛋白酶活性有所下降，但趋于平缓。随着交联时间的延长，戊二醛与壳聚糖二者的交联反应逐渐达到平衡，载体上的酶蛋白结合位点也不断被饱和，当交联时间进一步增加时，固定到载体上的酶蛋白的量基本恒定。因此合理控制交联时间也比较重要，本实验最终确定交联时间3h为宜。

2.5 酶用量的影响

图5 酶用量对固定化蛋白酶活力的影响Fig.5 Effect of proteinase amount on the activity of immobilized enzyme

载体上偶联的酶量直接影响着固定化酶的活力，由图5可知，开始随着酶用量值的升高，固定化酶的活力增加，但酶用量3mg时，固定化酶活力达到最大值，之后酶活力曲线随着酶使用量的升高而呈平缓趋势，这是因为戊二醛交联后的壳聚糖载体与酶结合的醛基数量是一定的。在本研究中，酶用量值为3mg时，固定化酶活力最大是25.6U。

2.6 响应面试验分析

根据单因素试验结果，以壳聚糖质量浓度、酶用量、交联时间、戊二醛质量浓度为变量，展开四因素三水平的响应面试验，试验结果见表2。

表2 Box-Behnken试验设计及其结果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

壳聚糖固定瑞士乳杆菌蛋白酶的条件优化根据Box-Behnken响应面分析设计进行了29组试验， 5组为中心点重复试验(表2)。利用Design-Expert 7.1.3软件对固定化酶活力(Y)进行多元回归拟合，得到未编码二次多项式拟合方程为：Y=30.16ˉ0.3583X1ˉ0.7167X2ˉ2.7417X3ˉ 0.2667X4+2.35X1X2ˉ0.675X1X3+1.65X2X3ˉ2.05X2X4+ 0.75X3X4ˉ4.855X12ˉ4.0425X22ˉ1.58X32ˉ6.4675X42。

表3 固定化酶活性的二次多项模型方差分析表Table 3 Variance analysis for the fitted quadratic polynomial model for the activity of immobilized enzyme

表4 固定化酶活力的回归方程系数显著性检验Table 4 Significance test of each regression coefficient in the fitted quadratic polynomial model for the activity of immobilized enzyme

图6 不同变量对固定化酶活力的响应曲面图Fig.6 Response surface plots for the effects of different variables on the activity of immobilized enzyme

从该模型的表3方差分析可见，本实验所选用的二次多项模型具有较高的显著性。其中R2Adj=0.9104，失拟项P=0.1534＜0.05，说明二次多项式回归模型正确，回归效果较好。用该模型对固定化蛋白酶的条件进行优化是合适的。由表4可知，交联时间(X3)的P值小于0.01，说明其对固定化酶活力的影响最为显著，影响固定化蛋白酶活性的因素为交联时间(X3)＞酶用量(X2)＞壳聚糖质量浓度(X1)＞戊二醛质量浓度(X4)。X1、X2和X4的二次项P值小于0.01，可以看出这3个因素对响应值的影响不是简单的线性关系，而是二次抛物线的关系，从图6可以看出响应面曲面弯曲，说明响应面的变化较为复杂。方程中交互项X1X2、X2X3、X2X4回归系数显著性较高，说明X1与X2，X2与X3，X2与X4交互影响显著，正符合图6中曲面弯曲较明显。运用Design Expert 7.13得出壳聚糖固定化瑞士乳杆菌蛋白酶活力的最佳条件为：壳聚糖质量浓度2.89g/100mL、酶用量2.95mg、交联时间1h、戊二醛质量浓度0.40g/100mL，此时固定化酶活力为28.67U。

2.7 验证实验

根据Box-Behnken试验所得的结果和二次多项回归方程，利用Design Expert 7.1.3软件获得了各个因素的最佳水解条件组合为壳聚糖质量浓度2.89g/100mL、酶用量2.95mg、交联时间1h、戊二醛质量浓度0.40g/100mL，此时固定化酶活力为28.67U。为了检验模型预测的准确性，选取壳聚糖质量浓度2.8g/100mL、酶用量3mg、交联时间1h、戊二醛质量浓度0.40g/100mL，做3组平行实验，固定化酶活力可达(28.40±0.67)U，所得结果与最佳条件下所得的结果误差均在±1%以内，由此可见，采用响应面分析法对瑞士乳杆菌蛋白酶的固定化条件的进行优化是可行的。

3 结 论

本实验利用壳聚糖固定化瑞士乳杆菌蛋白酶，通过单因素分析和响应面试验设计，确定了瑞士乳杆菌蛋白酶的固定条件：凝结液NaOH-甲醇(体积比3:1) 4g/100mL、壳聚糖质量浓度2.89g/100mL、酶用量2.95mg、交联时间1h、戊二醛质量浓度0.40g/100mL。本实验确定了壳聚糖固定化瑞士乳杆菌蛋白酶的固定化条件，为进一步实现ACE抑制肽的大规模生产及工业应用提供了参考。

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Optimization of Process Conditions for Immobilization of Lactobacillus helveticus Proteinase with Chitosan

WANG Cui-cui1，GUO Yu-xing1,*，PAN Dao-dong1,2
(1. Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China；2. School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

Immobilized Lactobacillus helveticus proteinase was prepared using chitosan as carrier and glutaraldehyde as crosslinking agent by adsorption and cross-linking method. The effects of condensate, chitosan concentration, enzyme amount, crosslinking time, and glutaraldehyde concentration on immobilization efficiency of Lactobacillus helveticus proteinase as indicated by the activity of immobilized proteinase were explored based on single factor experiments. The optimal immobilization conditions were determined by response surface analysis to be a mixture of NaOH and methanol at a ratio of 3:1 as condensate at a dose of 4 g/100 mL, 2.89 g/100 mL chitosan concentration, 2.95 mg enzyme amount, 1 h cross-linking time and 0.4 g/100 mL glutaraldehyde concentration.

Lactobacillus helveticus proteinase；immobilization；enzyme activity

TS252.54

A

1002-6630(2012)03-0110-06

2011-09-20

国家自然科学基金青年科学基金项目(31101314)；江苏省自然科学基金项目(BK2011787)；江苏省教育厅高校自然科学基金项目(10KJB550003)；南京师范大学特聘教授、高层次人才科研启动基金项目(184070H2B08)

王翠翠(1987—)，女，硕士研究生，研究方向为农产品加工。E-mail：yiyi-wcc@163.com

*通信作者：郭宇星(1981—)，女，讲师，博士，研究方向为乳品科学。E-mail：yuxingguo1981@yahoo.com.cn