扣带回脑区与癫痫大鼠学习记忆损害相关性分析

宋石磊 王莉 赵勇 张万琴

癫痫是常见的中枢神经系统疾病之一。目前对于癫痫的研究主要还是采用动物模型，其中海仁酸(KA)所致的癫痫模型已广泛用于癫痫发作的研究，被认为是经典的癫痫动物模型［1］。长期以来对于癫痫所致学习记忆障碍的研究主要集中在海马脑区，并且肯定了海马脑区与癫痫学习记忆障碍的相关性，但是对于扣带会在这方面的研究甚少。本研究通过对难治性癫痫大鼠脑内扣带回脑区C-Jun免疫反应性变化的观察，初步探讨扣带回与难治性癫痫空间学习记忆障碍的相关性。

1 材料与方法

1.1 制备及分组 KA诱发癫痫急性发作及癫痫持续状态取20只大鼠，一次颈部皮下注射惊厥剂量(10 mg/kg，2 ml/kg)的KA诱发SD大鼠出现癫痫急性发作及癫痫持续状态。癫痫的严重程度按Racine［2］描述的标准进行1～5级分级，在本实验中有12只大鼠有4级以上发作并呈持续状态，其中有5只死亡，7只存活大鼠被采用为癫痫模型即模型组。剩余未达到四级以上发作的10只大鼠有4只死亡，6只存活大鼠作为模型对照组，另取同批SD大鼠(n=6)颈部皮下注射等容积(2.0 ml/kg)的生理盐水即为空白对照组。

1.2 Morris水迷宫行为学测定 SD大鼠在分组完成后30 d采用Morris水迷宫通过隐藏平台获得实验及空间搜索实验对大鼠的学习记忆能力进行测定。

1.3 灌流固定

1.3.1 4%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠，开胸暴露心脏。

1.3.2 16 g注射针头刺入左室尖部，止血钳固定，剪开左心耳，先后以0.9%氯化钠注射液200 ml和4%多聚甲醛400 ml先快速后缓慢进行灌注，至肝脏、四肢及头尾变硬。

1.3.3 断头取脑，于4℃4%多聚甲醛中后固定。

1.4 脑片制备及免疫组织化学实验 将固定好的鼠脑放入含30%蔗糖的磷酸缓冲液中4℃过夜，振动切片机切取50 μm厚的冠状脑片，PBS漂洗10 min×2，与1%BSA孵育30 min;加入第一抗体(C-jun-Ab，1∶500)4℃孵育过夜，PBS漂洗10 min×2;加入生物素化羊抗兔(1∶400)室温振荡孵育1 h，PBS漂洗10 min 2;与卵白素生物素复合物A:B:PBS(1∶1∶400)室温振荡孵育2 h，二氨基联苯胺(DAB)法显色;适时用0.01 m PBS终止反应;明胶裱片，风干;梯度酒精脱水:70%、80%、90%、95%、100%、100%酒精各脱水 5 min;二甲苯透明，中性树胶封片、晾干。

1.5 图像分析 采用HPIAS系列彩色病理图文分析系统对C-Jun免疫阳性细胞进行定量计数，采用Olympus-BX51型显微摄像系统对目标脑区进行摄像。分析方法:选取扣带回为目标脑区，分别在扣带回5个不同层面分别选取4个宽度 和高度分别为213、289 μm的计数区，在显微镜下进行观察，计数C-Jun阳性细胞数目，取其平均值。并分别摄片。

1.6 统计学方法 实验采用SPSS 11.5软件进行统计处理。免疫组化数据采用均数±标准差，各组脑片之间的免疫活性差异采用单因素方差分析;不同处理组间的两两比较采用单因素方差分析S-N-K法;检验标准为P＜0.05。

2 实验结果

2.1 Morris水迷宫行为学测定结果

2.1.1 隐匿平台获得实验 模型组大鼠的寻找潜伏期在各个时间段都明显长于其它2组大鼠。并且其在学习测试的4 d中每天的寻找潜伏期没有明显差异(P＞0.05)。模型对照组与空白对照组的寻找潜伏期在各个时间段差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.1.2 空间探索试验 模型组大鼠穿越平台的次数平均为0.71，而其它2组分别为2.33次、3.29次，差异有统计学意义(P＜0.05)，模型对照组与空白对照组之间的差异无统计学意义(P＞0.05)。

2.2 免疫组织化学结果 在C-jun的免疫组化结果中，模型组大鼠扣带回脑区C-Jun免疫阳性细胞数目较空白对照组组和模型对照组大鼠明显降低，有显著差异(P＜0.05)。而模型对照组扣带回脑区C-Jun免疫阳性细胞数目与空白对照组相比则无明显差异(P＞0.05)。(图1、表1)。

图1 A模型组B模型对照组C空白对照组(200)

表1 各组大鼠扣带回脑区C-Jun阳性细胞数目

3 讨论

C-Jun是一种即刻早期基因(IEGs)，它的表达受控于突触的活动，有研究指出其在突触地可塑性机制(LTP)中发挥重要的作用，而LTP是目前公认的记忆形成基础［3］。在经过记忆训练的大鼠脑内可以观察到C-Jun蛋白表达的升高［4］，这些研究表明了C-Jun参与了学习记忆的形成过程。通过抑制C-Jun氨基末端激酶(JNKs)造成C-Jun mRNA和蛋白质合成的损伤，可以改善短时程记忆而阻断长时程记忆［5］，也说明了C-Jun与学习记忆的相关性。

现在共识的记忆形成的分子机制假说是:刺激发动长时程记忆的相关基因的表达进而启动分子级联反应，级联反应又可以调控IEGs的表达，最终达到记忆相关区域持久的结构和功能的改变［6］。在这个过程中随着各种类型的细胞兴奋，C-Jun会被诱导并表达，C-Jun的免疫反应活性可作为神经元兴奋的标志［7］。在大鼠学习过程中，学习记忆相关脑区如果C-Jun表达降低，就很有可能是该脑区的学习记忆机制受到了损害。

本实验中通过免疫组化实验对各组大鼠的扣带回脑区进行的观察发现实验组大鼠扣带回脑区内C-Jun有着相对较低的表达，与此相应的是在行为学实验中，模型组的学习记忆能力与空白组和实验对照组相比明显降低，而模型对照组与空白组相比学习记忆能力无明显差异。结合以上对C-Jun在学习记忆形成过程中作用的探讨，有理由认为实验组大鼠扣带回脑区内的学习记忆机制发生了损害。所以癫痫大鼠学习记忆能力的改变很可能与扣带回脑区学习记忆机制损害相关。

［1］Sperk G.Kainic acid seizures in therat.Prog Neurobiol，1994，42:1.

［2］Racine RJ.Modification of seizure activity by electrical stimulation.Ⅱ.Motor seizure.Electroencephalogr Clin Neurophysiol，1972，32:281.

［3］Herdegen T，Skene P，Bahr M.The c-Jun transcription factorbipotentialmediator of neuronal death，survival and regeneration.Trends Neurosci，1997，20:227-231.

［4］Lisa A，Teather，Mark G，Packard，et al.Differential induction of c-Jun and Fos-like proteins in rat hippocampus and dorsal striatum after training in two water maze tasks.Neurobiology of Learning and Memory，2005，84(2):75-84.

［5］Bevilaqua LR，Kerr DS，Medina JH，et al.Inhibition of hippocampal Jun N-terminal kinase enhances short-term memory but blocks long-term memory formation and retrieval of an inhibitory avoidance task.Eur J Neurosci，2003，17，897-902.

［6］P Goelet VF，Castelucci S，Schaecher，et al.The long and the short of long-term memory-a molecular framework.Nature，1986，322:419-422.

［7］J I Morgan，T Curran.Stimulus-transcription coupling in the nervous system:Involvement of the inducible proto-oncogenes fos and jun.Annual Review of Neuroscience，1991，14:42-451.