香菇多糖增强5－FU抑制结肠癌细胞增殖机制研究

袁昌劲，孔庆志，卢宏达，孔双喜

（1.武汉市中心医院 肿瘤科，湖北 武汉430014；2.华中科技大学附属同济医院 肿瘤科）

香菇多糖主要为甘露糖甘肽，其余为多种糖分和各种氨基酸等，对光和热稳定，不溶于甲醇、乙醇和丙酮等有机溶剂［1］，联合抗肿瘤药物对胃癌［2］、结肠癌［3］、肺癌［4］等肿瘤具有良好的疗效，显著延长肿瘤患者存活时间。目前对香菇多糖的抗肿瘤机制仍然不清楚，一般认为和免疫调节有关。香菇多糖是典型的T细胞激活剂，体内外均能促进细胞毒T淋巴细胞（CTL）的产生，提高CTL细胞杀伤力，增强正常或免疫功能低下小鼠的迟发型超敏反应，提高抗体依赖性细胞毒作用，同时能结合到人单核细胞上激活内源性信号传导通路［5，6］。本文应用香菇多糖及5－FU处理SW480结肠癌细胞，探讨其对细胞增殖和凋亡的影响，并研究其可能作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

SW480结肠癌细胞购于美国ATCC，RPMI－1640、双抗和FBS购于Gibco公司，MTT试剂购于Sigma公司，RNA 提取和 RT－PCR试剂盒购于Takara公司，引物由上海生工公司合成，香菇多糖采用南京康海药业有限公司的香菇多糖冻干粉剂，5－FU购于Sigma公司。

1.2 细胞培养和药物处理

SW480结肠癌细胞完全培养基为10%FBS、89%RPMI－1640和1%双抗，培养条件为37℃、5%CO2恒温培养箱，实验时取对数生长期细胞。香菇多糖冻干粉剂用生理盐水配制成5μmol／ml，5－FU用生理盐水配制成500mg／L存储液，根据王峻［7］和Harada［8］等研究，使用时加入完全培养基配制如下浓度工作液①Len组：Lentinan终浓度0.05 μmol／ml；②FU组：5－FU终浓度100mg／L；③L＋F组：Lentinan终浓度0.05μmol／ml和100mg／L 5－FU终浓度。

1.3 MTT法检测细胞增殖

每孔1000个细胞接种于96孔板，每孔200μl，加入工作液处理24h后，PBS洗涤3次更换新鲜培养基培养。每天MTT法检测一孔，每孔加入5 mg／ml MTT溶液20μl，37℃孵育4h后弃去，加入DMSO 50μl，振荡15min充分溶解结晶，酶标检测仪上测定波长为490nm下的吸光值（A值），每孔细胞吸光度＝测得值－空白对照孔值。以吸光值为纵坐标，以时间（天）为横坐标，绘制Len组、FU组、L＋F组和正常未处理组SW480结肠癌细胞增殖曲线。

1.4 流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡

药物处理24h后收集细胞并离心，细胞沉淀用PBS洗涤，加入标记有异硫氰酸荧光素的连接素Annexin V－FITC和碘化丙锭，避光孵育15min后检测细胞凋亡，另制成200μl细胞悬液，加入70%的冰乙醇5ml－20℃固定24h以上，加入RNase A 200μl，37℃温育30min，加入碘化丙啶至终浓度50mg／L，检测细胞周期。增殖指数（PI）＝（S＋G2／M）／（G0／G1＋S＋G2／M）。

1.5 RT－PCR检测多药耐药基因 MDR1、MRP1和LRP表达

按照RNA提取试剂盒说明提取细胞总RNA，用β－actin作为内参照进行RT－PCR扩增，引物序列参见表1。PCR反应体系为25μl，反应参数：94℃预变性5min，94℃变性45s，表1基因对应退火温度退火30s，72℃延伸30s，共35个循环，最后一轮72℃延伸10min。PCR产物经20g／L琼脂糖凝胶电泳后检测。

1.6 统计学分析

应用SPSS12.0进行数据处理与统计分析。采用t检验，P＜0.05认为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 SW480结肠癌细胞增殖

正常对照组SW480结肠癌细胞表现为对数增殖状态，单独5－FU处理后，增殖速度较对照组显著降低，增殖速度降低，细胞增殖受到抑制；单独香菇多糖对细胞增殖无明显影响，联合5－FU作用后的细胞增殖速度显著降低（图1）。

表1 MDR1、MRP1和LRP基因RT－PCR反应序列和退火温度

2.2 细胞形态与凋亡

镜下观察，FU组SW480结肠癌细胞体积缩小、死亡，细胞密度较对照组降低；Len组结肠癌细胞无明显细胞体积缩小和死亡，细胞密度和对照组无明显区别；香菇多糖联合5－FU处理后，死亡细胞增加，细胞密度较对照组显著降低，明显低于FU组。Len组与对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），FU组G0／G1期细胞明显增加，S期细胞降低，PI明显降低，细胞凋亡率显著提高（P＜0.05），L＋F组与FU组和对照组相比，细胞凋亡率显著增加，PI降低，细胞停滞于G0／G1期，差异具有统计学意义（P＜0.05）（表2）。

图1 SW480结肠癌细胞增殖曲线

表2 SW480结肠癌细胞细胞周期与凋亡（±s）

表2 SW480结肠癌细胞细胞周期与凋亡（±s）

与对照组相比，＊P＜0.05，＃P＞0.05；a、b和c之间，P＜0.05

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2.3 RT－PCR检测耐药基因表达

正常对照组SW480结肠癌细胞均可检测到MDR1、MRP1和LRP基因mRNA表达，加入5－FU药物处理后，MDR1基因表达增加，MRP1和LRP基因表达无明显变化。香菇多糖能显著降低MDR1和MRP1基因表达，而对LRP表达无影响。香菇多糖联合5－FU抑制MDR1和MRP1基因表达，表达呈缺失状态，而对LRP基因表达无影响（图2、图3和图4）。

3 讨论

图2 MDR1基因mRNA表达

图3 MRP1基因mRNA表达

图4 LRP基因mRNA表达

接受化疗的患者在初次或再次接受化疗时可能出现耐药现象，药物敏感度低于正常人。目前认为肿瘤细胞的耐药主要和诱导表达多药耐药基因相关，多药耐药基因主要包括MDR1、MRP1和LRP［9］。MDR1基因编码产物P－糖蛋白位于细胞膜，由两个完全相同的单体结构构成每个单体有一个ATP结合位点，跨膜区域构成药物通道盒式结构，ATP结合位点与能量供应有关，P－糖蛋白利用ATP水解功能将抗肿瘤药物泵出胞膜外［10］。MRP1基因编码的多药耐药相关蛋白1属于非P－gp跨膜糖蛋白ATP依赖泵，能将带负电荷的药物分子逆浓度泵出到胞外，减少胞内药物浓度，还可改变细胞浆及细胞器的pH值，使药物到达作用部位的靶位点时浓度减少，避免药物与靶点结合，直接参与肿瘤的转移［11］。LRP广泛分布于正常组织，使顺铂不能通过核孔进入细胞核，阻止以胞核为效应点的药物转运到胞浆中；将进入胞浆的药物转运到运输囊泡中，起隔绝药物作用，最终通过胞吐的方式到细胞外，主要介导烷化剂的耐药［12］。目前研究表明，人工抑制多药耐药基因表达能显著改善耐药现象，提高化疗药物的疗效。

5－FU为细胞周期特异性药，主要抑制S期细胞。在体内转变为5－氟－2－脱氧尿嘧啶核苷酸，抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，阻断脱氧尿嘧啶核苷酸转变为脱氧胸腺嘧啶核苷酸而抑制DNA的生物合成。研究表明，梯度5－FU浓度刺激导致细胞多药耐药基因表达增加，利用该机制已经成功制备5－FU耐药细胞株［13，14］。本研究表明 5－FU 接触 SW480结肠癌细胞后，MDR1表达增加，该现象与Theile等［15］研究一致。香菇多糖能显著降低 MDR1和MRP1基因表达，而对LRP表达无影响，其具体作用机制有待进一步研究。

5－FU为S周期特异性抑制剂，抑制细胞进入有丝分裂器，本研究也证实该现象。5－FU联合香菇多糖后，细胞仍然表现为停滞于G0／G1期特点，表明香菇多糖并没有改变5－FU作用特点，但细胞增殖速度明显降低，凋亡增加，我们推测是香菇多糖增加了SW480结肠癌细胞对5－FU的敏感性。香菇多糖能显著降低多药耐药基因表达，正是该机制导致SW480对5－FU诱导耐药作用减少，从而增加了细胞对5－FU的敏感度，但两者之间是否存在因果关系，有待进一步研究。

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