口服枸杞多糖对实验性食管癌大鼠免疫功能影响的研究

杨书良，郝玉栓＊，单铁英，胡素红

（1.河北工程大学医学院，河北 邯郸056029；2.邯钢职工医院）

枸杞多糖（lycium barbarum polysaccharides，LBP）作为枸杞子的主要活性成分已日益得到临床医生的高度重视。研究表明，LBP有增强机体的免疫功能和显著的抗肿瘤效应，它能从调动机体自身的抗病能力出发，在提高机体免疫力的同时杀伤肿瘤细胞［1］；它能促进骨髓有核细胞数和粒／巨噬细胞集落数量的增加（CFU－GM）；它还能诱导体内多种细胞因子的产生，而这些因子均有促进免疫活性细胞增殖、分化和成熟的作用。所以临床上普遍认为LBP有较强的免疫活性，是有效的免疫增强剂，在细胞免疫和体液免疫中具有十分重要作用［2］。LBP的抗肿瘤作用是否与机体在肿瘤发生过程中，免疫效应细胞（如CD4＋T，CD8＋T）和细胞因子（如IL－2、IL－10）增减有关，目前报道较少。本研究以NMBA诱导大鼠食管癌为对象，观察LBP在诱癌过程中对CD4＋T、CD8＋T细胞和血清IL－2、IL－10水平的影响，探讨其防癌、抗癌作用的免疫学机制，为进一步开发免疫增强剂的抗肿瘤药物提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物

5～6周龄清洁级健康雄性F－344大鼠96只，购于上海斯莱克实验动物中心。

1.2 试剂与仪器 LBP由华北制药集团新药研究开发中心分离纯化，纯度＞90%。NMBA（Osaka，Japan），纯度 ＞98%。IL－2ELISA 试 剂 盒、IL－10 ELISA试剂盒（ADL）。小鼠抗大鼠CD4－FITC单抗（Caltag）。小鼠抗大鼠CD8－PE单抗（BD）。流式细 胞 仪 （FACS Vantage，Becton Dickin Son）。SCR20B型低温高速离心机（日本HITACHI公司）。－80℃超低温冰箱（SANYO）。双目光学显微镜、显微照像机（Olympus）。切片机（Leica）。

1.3 方法

1.3.1 动物实验 大鼠恒温（22～25℃）、恒湿（40～60%），灭菌饲料饲养。两周后随机将大鼠分为对照组、LBP组、NMBA诱癌组和诱癌＋LBP组，每组24只。对照组大鼠生理盐水灌胃5ml／kg／次／日；LBP组大鼠 LBP灌胃5ml／10mg／kg／次／日；NMBA诱癌组大鼠每周3次皮下注射NMBA（0.5 mg／kg／次）；诱癌＋LBP组大鼠在每周3次皮下注射 NMBA（0.5mg／kg／次）的同时LBP灌胃5ml／10mg／kg／次／日，所有大鼠用药时间共6周。分别在第6、12和18周时从各组大鼠中取8只麻醉后解剖，取食管进行病理学观察；采外周血做CD4＋和CD8＋T细胞数，ELISA检测技术检测血清IL－2、IL－10水平。

1.3.2 病理学观察 将大鼠食管纵行剖开平铺，肉眼观察食管癌前病变发生情况，并对发生瘤体测量大小和计数；取食管黏膜，常规石蜡包埋、制片，HE染色，在双盲情况下光镜观察。

1.3.3 外周血CD4＋T、CD8＋T细胞检测 取不同荧光标记的单克隆抗体各10μl，分别加入100μl肝素抗凝的全血，室温下孵育15min，加入红细胞裂解液，PBS洗涤2次，用流式细胞仪检测。测定5000个细胞，记录CD4＋T、CD8＋T细胞分别占淋巴细胞的百分比。

1.3.4 血清IL－2、IL－10含量检测 按照说明书测定。

1.4 统计学分析

所有实验数据用SPSS17.0软件进行统计学处理，实验结果以均数±标准差（x—±s）表示，各组均数的比较采用单因素方差分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般状况

实验期间各组大鼠体重呈正常生理性增长，各组间平均体重变化差异无统计学意义，第4周后，诱癌组大鼠出现皮毛蓬松，活动减少，弓背卷缩现象，但体重仍在增长。

2.2 病理变化

对照组、LBP组大鼠各时间点肉眼观察，食管黏膜光滑，色泽正常，未发现肿瘤生长；诱癌组大鼠食管黏膜出现肉眼可见的多发或单发的隆起性病变（最大径≥1mm为标准）。镜下观察对照组、LBP组大鼠食管黏膜上皮细胞无异常表现；诱癌组大鼠食管黏膜上皮表现为基底层细胞大小不一、核浆比例失调、核染色加深、核膜增厚等上皮内瘤变表现（以Ⅲ级为计算标准）；诱癌＋LBP组大鼠食管黏膜上皮细胞变化明显减轻（表1）。实验结果充分说明NMBA诱发大鼠食管模型可靠，LBP对食管黏膜癌变的发生有一定的抑制作用。

2.3 外周血CD4＋T、CD8＋T细胞

各组测定结果见表2。

2.4 血清IL水平

见表3。

表1 不同组别大鼠食管肿瘤发生率和食管黏膜上皮内瘤变Ⅲ级发生率（%，n＝8）

表2 不同组别大鼠外周血CD4＋T细胞、CD8＋T细胞（%，n＝8，x—±s）

表3 不同组别大鼠血清IL－2、IL－10水平（pg／ml，n＝8，x—±s）

3 讨论

传统中草药以低毒、价廉、有效、易于接受等优点在肿瘤防治研究领域越来越受到人们的关注［3］。枸杞子性平、味甘，具有滋补肝肾、益精明目的功效，LBP是枸杞子经脱脂、水提、反复醇析所得。LBP具有较强的免疫活性，是有效的免疫增强剂，在细胞免疫和体液免疫中具有十分重要作用［4］。本研究以NMBA诱发食管癌大鼠为实验模型，探讨LBP在其诱癌过程中抗肿瘤作用的免疫学机制，为开发以免疫增强剂为主的防治肿瘤药物提供参考。

外周血CD4＋、CD8＋T细胞数量的多少及血清细胞因子水平的高低，可直接反映出机体的免疫状态，研究发现肿瘤患者外周血中CD4＋、CD8＋T细胞数量减少，导致机体抗肿瘤免疫反应降低，最终发生肿瘤。LBP作为一种“植物疫苗”进入肠道后，可通过抗原递呈细胞上的“MHC－肽”与T细胞受体（TCR）聚合。CD4或CD8的存在可稳定TCR和MHC－肽之间的相互作用可使免疫受体酪氨酸激活基序 （ITAM）发 生 磷 酸 化 从 而 激 活 T 细 胞［5－8］。CD4＋T细胞是一群具有调节体液和细胞介导免疫功能的细胞，他们的分化受许多因素的影响，其中最重要的因素就是细胞因子。IL－2在机体免疫调节网络中处于中心地位，IL－2能促进外周血单核细胞产生TNF，从而增强抗肿瘤的作用。由于IL－2的含量与机体的免疫功能相关，尤其是与细胞免疫功能密切相关，因此可将IL－2的产生作为细胞免疫效应的主要指标。静止的自然杀伤细胞（NK细胞）表达IL－2受体的β链，一种70kDa的中等亲和力受体，IL－2可直接将其激活，NK细胞激活后能释放γ干扰素（IFNγ）和其他细胞因子杀伤瘤细胞［9－11］。所有这些细胞都能对IL－2产生反应，获得非特异细胞毒功能，这些细胞统称为淋巴因子活化的杀伤细胞（LAK细胞）。LAK细胞与NK细胞相比，它不但能杀伤新鲜的肿瘤细胞，而且对许多不同谱系的肿瘤细胞也有杀伤作用。本研究显示，LBP具有增加外周血CD4＋、CD8＋T细胞和增加细胞因子IL－2的分泌的作用，可形成较强的免疫活性，是有效的免疫增强剂，在细胞免疫和体液免疫中具有十分重要作用。

人体肿瘤的发生发展与免疫功能的改变有着密切的关系，由于机体免疫监视的缺陷，导致免疫逃逸的发生，使肿瘤发生率增高。肿瘤发生时肿瘤细胞本身也可分泌IL－10，IL－10通过抑制单核／巨噬细胞、Th细胞、CTL细胞和NK细胞等来抑制机体对肿瘤的免疫作用，使肿瘤细胞发生逃逸现象。在恶性肿瘤病人中血清IL－10大多数情况下是增高的，且IL－10的高低与肿瘤病人的治疗效应和病情相关，血清IL－10增高的肿瘤患者在经手术或化疗后明显下降［13－15］。本研究显示，诱癌组大鼠血清IL－10水平在第6周明显升高，随着时间的推移虽然有所下降，但下降并不明显。诱癌＋LBP组大鼠血清中IL－10水平明显低于诱癌组大鼠，但高于对照组和LBP组。12周前血清IL－10水平显著下降，12周下降不明显，与诱癌组各时间点比较差异有统计学意义，但与对照组各时间点比较差异无统计学意义。研究结果说明NMBA诱癌过程中，大鼠的抗肿瘤免疫状态是受抑制的，血清IL－10水平可反映出肿瘤患者抗肿瘤免疫状态。

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