中华大蟾蜍皮肤galectin-3 cDNA分子多样性及氨基酸变异分析

徐 跃，宋敏国，杨仙玉，袁进强

（浙江农林大学 林业与生物技术学院，浙江 临安 311300）

半乳糖凝集素（galectins）是动物凝集素的一类，具有高度保守的糖识别结构域（carbohydrate recognition domain，CRD），能特异性识别并结合β-半乳糖苷[1]。目前，已从动物组织和细胞中分离到15个galectin家族的成员，在细胞核、细胞质、细胞表面、细胞基质和生物体液中都有发现[2]。galectin-3（gal-3）是该家族中唯一的嵌合型代表[1]，作为一个多功能蛋白，参与胚胎发育、细胞黏附和增殖、凋亡、mRNA剪切、细菌定植、调节免疫反应等[3-7]。该蛋白由3个不同的结构域组成：①12个氨基酸残基组成的N-端结构域，其中ser6磷酸化位点具有调节细胞靶向的作用；②富含甘氨酸（gly），酪氨酸（tyr）和脯氨酸（pro）串联重复序列的类胶原结构，作为基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）的底物；③140个氨基酸残基组成的CRD，包含凋亡基因Bcl-2家族同源序列BH1中的保守基序NWGR（asp-trp-gly-arg），该基序被认为是抑制凋亡活性的关键结构[6，8]。gal-3通过糖基识别系统与细胞表面受体多糖的结合和交联，从而介导信号转导[2]，在不同的生物过程中发挥作用。CRD区域包含与晚期糖基化终末产物（advancedglycation end products，AGEs）结合的位点，和全部的糖基结合位点，因此被认为是gal-3凝集功能的活性中心[2]。本实验室从中华大蟾蜍Bufo gargarizans皮肤中克隆到一个galectin-3基因（登陆号：AEX58672.1）[9]，并在后续实验中共获得了9个不同的galectin-3 cDNA克隆。本研究对其核苷酸序列以及推导蛋白质的氨基酸序列进行比对和分析，将有助于了解中华大蟾蜍对环境适应性的机制及gal-3蛋白的生物学功能。

1 材料与方法

1.1 试验动物

健康中华大蟾蜍采自浙江农林大学东湖校区。将蟾蜍体表冲洗干净，处死后剥离皮肤，投入液氮中冷冻，保存在-70℃超低温冰箱中备用。

1.2 主要材料和试剂

大肠埃希菌Escherichia coli感受态细胞DH5α，聚合酶链式反应（PCR）试剂盒，Quantscript RT kit及pGM-T载体购自Tiangen公司，限制性核酸内切酶EcoRⅠ购自Takara，脱氧核糖核酸（DNA）梯度和质粒小量抽提试剂盒购自碧云天生物技术研究所，核糖核酸（RNA）提取试剂盒购自上海博彩生物技术公司。

1.3 方法

1.3.1 引物 上游引物P1为：5′-ATGTCTGACGGCTTTTCG-3′；下游引物P2为：5′-TTACACTGTAGTTAAGGAAG-3′，均由上海桑尼生物科技有限公司合成[9]。

1.3.2 皮肤总RNA的制备 取中华大蟾蜍皮肤组织，按RNA提取试剂盒说明提取皮肤组织总RNA，琼脂糖电泳检测RNA的完整性，用紫外分光光度计检测RNA溶液浓度和纯度。

1.3.3 反转录反应 采用Quantscript RT kit（cDNA第1链合成试剂盒）合成第1链cDNA。

1.3.4 PCR扩增galectin-3基因片段 以反转录合成的cDNA第1链为模板进行PCR，各反应成分如下：cDNA 模板 1.0 μL， 10 × PCR 缓冲液 1.0 μL， 氯化镁（25mmol·L-1）1.2 μL， 使用引物 P1 和 P2（2μmol·L-1）各1.0 μL， 脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）（10mmol·L-1）0.8 μL， Taq 酶（5×16.67 mkat·L-1）0.2 μL， 补加灭菌去离子水至20.0 μL。反应条件为：94℃ 5 min，（94℃ 30 s，50℃ 30 s，72℃ 45 s）×30循环，72℃ 8 min。 使用 10 g·L-1琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 产物（5.0 μL）。

1.3.5 pGM-T载体连接和转化 PCR产物0.5 μL，pGM-T 1.0 μL，2×T4 DNA快速连接缓冲液5.0 μL，T4 Ligase 1.0 μL，灭菌去离子水补足至10.0 μL，23℃连接10 min。连接产物2.0 μL电击转化到大肠埃希菌 DH5α感受态细胞中（40.0 μL），迅速加入160.0 μL LB（Luria-Bertani）培养液，37℃振荡培养45 min，取50.0 μL培养液均匀涂布于含氨苄青霉素（100 mg·L-1），异丙基-β-D硫代半乳糖苷（IPTG，24 mg·L-1）， 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal， 40 mg·L-1）的 LB 平板， 37 ℃倒置培养过夜。

1.3.6 重组质粒的鉴定和序列测定 从LB平板随机挑取16个白色单克隆，接种于3.5 mL LB培养液中（含氨苄青霉素100 mg·L-1），37℃振荡培养过夜，质粒小量提取试剂盒提取质粒，并对质粒进行DNA限制性内切酶 EcoRⅠ消化。 酶切反应体系10.0 μL： 质粒1.0 μL，10×K 缓冲液1.0 μL，EcoRⅠ0.2 μL，灭菌去离子水补足至10.0 μL；37℃1 h。取5.0 μL酶切产物进行10 g·L-1琼脂糖凝胶电泳，确定阳性克隆及质粒的浓度，制备DNA测序样品。

1.3.7 DNA测序与序列分析 将确定为阳性的重组质粒命名为pGM-T-gal-3，委托上海桑尼有限公司使用载体上游引物T7和下游引物SP6对目的基因片段分别进行正向和反向测序。测序结果经美国国家生物技术信息中心（NCBI）的ORF Finder程序（http： //www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/orfig.cgi）查找galectin-3基因的ORF，推导出氨基酸序列。Clustal X2.0多序列比对用于蟾蜍皮肤galectin-3 cDNA序列多样性分析与氨基酸位点突变分析；运用DnaSP 4.0软件分析核苷酸多样性；利用MEGA 4.0软件构建进化树。

2 结果与分析

2.1 测序结果

使用ORF Finder程序分析序列，获得9个不同的中华大蟾蜍galectin-3克隆，分别命名为：gal-3-1，gal-3-2， gal-3-3， gal-3-5， gal-3-6， gal-3-7， gal-3-9， gal-3-11， gal-3-13， 编码区长度分别为 804， 789，759， 735， 798， 522， 732， 552 和 729 bp， 各自编码 267， 262， 252， 244， 265， 173， 243， 183 和242个氨基酸残基（图1～2）。其中gal-3-7和gal-3-11编码N-端截短型蛋白。本研究选择编码galectin-3C（N端截短型galectin-3）区域的522 bp进行比对分析（图1）。

2.2 N-端缺失突变

与gal-3-1相比，gal-3-7和gal-3-11在ORF的5′端前缺失了部分核苷酸，导致阅读框架发生改变，从而使gal-3-7和gal-3-11编码的蛋白在N端失去了部分氨基酸残基，翻译产物对应gal-3C。gal-3-7和gal-3-11分别由522和552个碱基组成，各自编码由173和183个氨基酸组成的蛋白质（图1～2）。N-端缺失突变体的发现将为galectin-3结构与组成的研究提供参考。

2.3 分子多样性

以gal-3-1 cDNA序列为标准，进行了核苷酸变异位点的分析（表1）。在galectin-3 C-端的522 bp区域共检测到26个变异位点，约占分析位点的4.98%，11个为非同义突变，15个为同义突变，平均每20 bp出现1个SNP，呈现出高密度的单核苷酸多态性（SNP）。SNP的主要原因包括碱基转换与颠换、插入与缺失（图1）。9个cDNA序列之间除了个别核苷酸位点发生了突变外，gal-3-6在81～89 bp间插入了“TCCAACTGC”序列（图 1）。

表1 中华大蟾蜍galctin-3C基因编码区核苷酸多样性分析Table1 Analysis of nucleotide diversity in galectin-3C coding region of Bufo gargarizans

用软件DnaSP 4.0对galectin-3C基因序列进行了中性检验，9个样本的平均核苷酸差异数为7.16667，核苷酸多样度为1.37%，进行Tajima’s D，Fu-Li’s F，Fu-Li’s D检验，3种中性检验值均为负值且未达到显著水平（P＞0.10），表明galectin-3C序列符合中性突变假说，呈中性进化。

2.4 氨基酸位点突变

多序列比对分析，发现中华大蟾蜍与人的gal-3在N端前16个氨基酸位点相当保守。gal-3在富含酪氨酸，脯氨酸和甘氨酸的串联重复序列中保守性较差，彼此之间表现出较大的差异性。在中华大蟾蜍gal-3中发现大量富含酪氨酸，脯氨酸和甘氨酸的串联重复序列“QP（A）QQY（F）PG”和“QQYPG”，且在各序列中的重复频率不同，可能暗示了gal-3是从富含脯氨酸/甘氨酸单元的祖先进化几次之后而来的。中华大蟾蜍与哺乳动物gal-3氨基酸序列存在差异，但在糖基结合关键位点和基序上与人gal-3蛋白具有一定的保守性。中华大蟾蜍gal-3在ser6上高度保守，可能是其磷酸化位点。对中华大蟾蜍gal-3的糖识别结构域（CRD）氨基酸序列进行分析发现：保守基序HFNPRF在中华大蟾蜍gal-3蛋白中变异为HCNPRF，而另一保守基序WGXEXR在中华大蟾蜍gal-3 CRD中高度保守。

2.5 中华大蟾蜍galectin-3的进化树分析

以 Xenopus（Silurana） tropicalis（NP_988986.1）和 Xenopus laevis （NP_001079643.1）的氨基酸序列为外群，与本实验获得的9个中华大蟾蜍galectin-3的cDNA推导的氨基酸序列构建了N-J系统进化树（图3）。结果显示本研究中的9个克隆聚为一枝，与Xenopus（Silurana）tropicalis和Xenopus laevis的galectin-3分属2枝。提示中华大蟾蜍与Xenopus（Silurana）tropicalis和Xenopuslaevis的galectin-3之间存在种属差异性。

图1 中华大蟾蜍编码galectin-3C的cDNA多序列比对Figure1 Multiple sequence alignment of cDNAs of galectin-3C of Bufo gargarizans

图2 中华大蟾蜍编码galectin-3多序列氨基酸比对Figure2 Multiple sequence alignment of amino acid sequences of galectin-3 of Bufo gargarizans

3 讨论

3.1 galectin-3分子多样性与两栖类动物的生物学适应意义

两栖类动物皮肤裸露、潮湿，利于微生物生长，为了抵御病原微生物的侵袭，在长期自然进化过程中形成了独特的防御微生物侵袭机制[10]。两栖类皮肤功能基因组具有多样性丰富、快速重组突变的特征，是探讨生物适应的基因基础、基因形成机制和进化特性等生物学基本问题的优秀模型[11]。有研究表明，一些生物有机体能快速地改变表型特征来适应各种逆境的环境，就是与基因中的重复序列在DNA和RNA或者蛋白质合成过程中产生的滑动错配而诱导产生有关[12]。

本实验发现在同一个中华大蟾蜍个体中出现多个不同galectin-3序列的情况，呈现出分子多样性（图1和表1），从而导致了gal-3在氨基酸组成上的多样性（图2），这或许是生物快速适应外界环境变化的分子基础。本研究的研究结果与前人对大蹼铃蟾Bombina maxima皮肤分泌物Maximin及Maximin H抗菌肽分子多样性，滇蛙Rana pleuraden皮肤抗感染多肽cDNA序列多样性，黑带蛙Rana nigrovittata皮肤中缓激肽类似肽（bradykinin-related pepetides，BRP）结构多样性等的研究结果共同揭示了两栖动物的生物学适应的分子生物学机制[11，13-14]。

图3 中华大蟾蜍和爪蟾galectin-3分子进化树Figure3 Phylogenetic tree of galectin-3 composed by comparing Bufo gargarizans with two Xenopus spp.

3.2 中华大蟾蜍gal-3的功能预测

推导的氨基酸序列比对显示这9个序列在串联重复区存在较大差异，主要是重复单元 “QP（A）QQY（F）PG”和“QQYPG”出现频率不同（图2），但与人gal-3在N端和CRD域有较高一致性，主要表现在磷酸化位点、糖基结合位点和相关基序上。

中华大蟾蜍与人的gal-3在N端前16个氨基酸位点相当保守（图2）。有研究表明：缺失开始的11个氨基酸会导致gal-3的分泌封闭[15]，而ser6在哺乳动物gal-3中承担着调节成纤维细胞的磷酸化的任务[16-17]，磷酸化可以大大降低gal-3与多价配基的结合[18]。ser6是酪蛋白激酶I（CKI）在体外的有效底物[19]，并且ser6附近保守的asp3对于CKI底物的识别非常重要[20]。而突变ser6则封闭了gal-3抑制失巢凋亡（anoikis）的能力[21]。氨基酸序列比对表明，中华大蟾蜍gal-3在ser6与asp3高度保守（图2），可能具有类似哺乳动物gal-3中ser6磷酸化位点的功能。

gal-3在糖识别结构域（CRD）的保守性主要表现在糖基结合位点和相关基序上。不同galectins之间CRD的氨基酸序列存在差异，但它们都享有2个保守的氨基酸基序HFNPRF和WGXEXR（X为任意氨基酸）。HFNPRF基序中的组氨酸（H），天门冬酰胺（N）和精氨酸（R），WGXEXR基序中的色氨酸（W），谷氨酸（E）和精氨酸（R）已经被X-射线晶体衍射和氨基酸定点突变证明它们参与galectins的糖结合过程[22]。我们对来自中华大蟾蜍和人的gal-3 CRD氨基酸序列进行分析发现：人gal-3蛋白中存在的保守基序HFNPRF，在中华大蟾蜍gal-3蛋白中变异为HCNPRF，所有gal-3氨基酸序列中均存在保守基序WGXEXR（图2）。核磁共振显示，配体能诱导人gal-3糖基结合位点附近回路（loop环）的构象改变，163～169位氨基酸之间的回路（FNENNRR）并不直接参与糖基结合，但在凋亡机制中对调节gal-3与其他蛋白作用是必需的，177～184位氨基酸间的回路（LDNNWGRE）包含NWGR基序，直接参与糖基结合[23]。中华大蟾蜍gal-3在这2个回路的氨基酸位点上保守性略低（图2），是否影响到这些区域的功能还有待研究。X-射线衍射分析表明：人gal-3的关键糖基结合位点有arg144，his158，asn160，arg162，glu165，asn174，trp181，glu184和arg186[24]。通过多序列对比分析，发现中华大蟾蜍的9条推导氨基酸序列在9个关键糖基结合位点上完全保守（图2），预测中华大蟾蜍gal-3具有结合糖基的功能。

[1]DUMIC J， DABELIC S， FLÖGEL M.Galectins： an open-ended story [J].Biochim Biophys Acta， 2006， 1760 （4）：616-635.

[2]ARGÜESO P， PANJWANI N.Focus on molecules： galectin-3 [J].Exp Eye Res， 2011， 92 （1）： 2-3.

[3]HUGHES R C.Galectins as modulators of cell adhesion [J].Biochimie， 2001， 83 （7）： 667-676.

[4]RABINOVICH G A， RIERA C M， LANDA C A， et al.Galectins： a key intersection between glycobiology and immunology [J].Brazil J Med Biol Res， 1999， 32 （4）： 383-393.

[5]RABINOVICH G A， BAUM L G， TINARI N， et al.Galectins and their ligands： amplifiers， silencers or tuners of the inflamatory response？ [J].Trends Immunol， 2002， 23 （6）： 313-320.

[6]LIU Futong， PATTERSON R J， WANG J L.Intracellular functions of galectins [J].Biochim Biophys Acta， 2002， 1572（2/3）： 263-273.

[7]KRZESLAK A， LIPINSKA A.Galectin-3 as a multifunctional protein [J].Cell Mol Biol Lett， 2004， 9 （2）： 305-328.

[8]徐跃，杨仙玉.Galectin-3及其相关抑制剂的研究进展[J].中国生化药物杂志，2011，32（5）：417-421.XU Yue， YANG Xianyu.Recent development in galectin-3 and its inhibitors [J].Chin J Biochem Pharm， 2011， 32 （5）：417-421.

[9]徐跃，宋敏国，杨仙玉，等.中华大蟾蜍galectin-3基因的克隆、序列分析及其原核表达载体的构建[J].西南大学学报：自然科学版，2012，34（4）：46-52.XU Yue， SONG Minguo， YANG Xianyu， et al.Cloning and analysis of Bufo gargarizans galectin-3 gene and construction of its prokayotic expression vector [J].J Southwest Univ Nat Sci Ed， 2012， 34 （4）： 46-52.

[10]赖仞，冉永禄.两栖类皮肤活性肽与活性生物胺[J].大自然探索，1999，18（67）：71-74.LAI Ren， Ran Yonglu.Active peptides and biological amines distributed in amphibian skin secretions [J].Explor Nat，1999， 18 （67）： 71-74.

[11]张云.两栖类动物皮肤分泌物及其生物学适应意义：大蹼铃蟾皮肤分泌物蛋白质多肽组的启示[J].动物学研究，2006， 27 （1）： 101-112.ZHANG Yun.Amphibian skin secretions and bio-adaptive significance-implications from Bombina maxima skin secretion proteome [J].Zool Res， 2006， 27 （1）： 101-112.

[12]ROCHA E P， MATIC I， TADDEI F.over-representation of repeats in stress response genes： A strategy to increase versatity under stressful conditions [J].Nucl Acid Res， 2002， 30 （9）： 1886-1894.

[13]王旭.滇蛙皮肤抗感染多肽的分离纯化、分子克隆及多样性研究[D].南京：南京农业大学，2008.WANG Xu.Purification， Characterization， Molecular Cloning and Diversity Analysis of Anti-infective Peptides from Rana pleuraden Skin [D].Nanjing： Nanjing Agricultural University， 2008.

[14]陈利华.黑带蛙（Rana nigrovittata）皮肤中胆囊收缩素和缓激肽的分离纯化、分子克隆及结构研究[D].南京：南京农业大学，2008.CHEN Lihua.Molecular Diversity，Structures and Functions of Antimicrobial Peptides from Skin of Rana nigrobittata[D].Nanjing： Nanjing Agricultural University， 2008.

[15]GONGHC， HONJOY， NANGIA-MAKKERP， etal.TheNH2terminusofgalectin-3governscellular compartmentalization and functions in cancer cells [J].Cancer Res， 1999， 59： 6239-6245.

[16]YAMAZAKI K， KAWAI A， KAWAGUCHI M， et al.Simultaneous induction of galectin-3 phosphorylated on tyrosine residue， p21WAF1/CIP1/Sdi1， and the proliferating cell nuclear antigen at a distinctive period of repair of hepatocytes injured by CCl4[J].Biochem Biophys Res Commun， 2001， 280 （4）： 1077-1084.

[17]TSAY Y G， LIN N Y， VOSS P G， et al.Export of galectin-3 from nuclei of digitonin-permeabilized mouse 3T3 fibroblasts [J].Exp Cell Res， 1999， 252 （2）： 250-261.

[18]MAZUREK N， CONKLIN J， BYRD J C， et al.Phosphorylation of the beta-galactoside-binding protein galectin-3 modulates binding to its ligands[J].J Biol Chem， 2000， 275 （46）： 36311-36315.

[19]HUFLEJT M E， TURCK C W， LINDSTEDT R， et al.L-29， a soluble lactose-binding lectin， is phosphorylated on serine 6 and serine 12 in vivo and by casein kinase I [J].J Biol Chem， 1993， 268 （35）： 26712-26718.

[20]SONGYANG Z， LU K P， KWON Y T， et al.A structural basis for substrate specificities of protein Ser/Thr kinases:primary sequence preference of casein kinases I and II， NIMA， phosphorylase kinase， calmodulin-dependent kinase II， CDK5， and Erk1 [J].Mol Cell Biol， 1996， 16 （11）： 6486-6493.

[21]YOSHII T， FUKUMORI T， HONJO Y， et al.galectin-3 phosphorylation is required for its anti-apoptotic function and cell cycle arrest[J].J Biol Chem， 2002， 277 （9）： 6852-6857.

[22]王婧.捻转血矛线虫galectin C端CRD差异氨基酸突变对其生物学活性的影响[D].南京：南京农业大学，2007.WANG Jing.The Mutation of the Diversity Amino Acid in the C Terminal CRD of Galectins of Haemonchus Contortus Affects the Bioactivities of the Recombinant[D].Nanjing： Nanjing Agricultural University， 2007.

[23]UMEMOTO K， LEFFLER H， VENOT A， et al.Conformational differences in liganded and unliganded states of galectin-3 [J].Biochemistry， 2003， 42 （13）： 3688-3695.

[24]SEETHARAMAN J， KANIGSBERG A， SLAABY R， et al.X-ray crystal structure of the human galectin-3 carbohydrate recognition domain at 2.1-A◦resolution [J].J Biol Chem， 1998， 273 （21）： 13047-13052.