牛组织中氨丙啉残留的HPLC检测方法研究

陆春波，陈慧华，林仙军，应永飞，周 炜，罗成江

(浙江省兽药监察所，杭州 310020)

氨丙啉(amprolium)，化学名1－〔(4－氨基－2－丙基－5－嘧啶基)甲基〕－2－甲基吡啶氯化物，是一种抗原虫药，从1960年开始就被广泛应用于防治球虫病，具有高效、安全，不易引起球虫耐药性等优点。氨丙啉毒性虽低，但长期高浓度应用能引起雏鸡硫胺缺乏而表现多发性神经炎，对产蛋鸡禁用，水貂、牛、羊可用。随着氨丙啉在养殖业中的广泛应用，其在动物性食品中的残留问题也日益突出。美国FDA、日本、韩国、加拿大等国家均规定了氨丙啉在动物组织中的最高残留限量，我国也作了相关规定。农业部制定了牛组织中的最高残留限量(MRL)［1］(牛肌肉500 μg/kg，牛脂肪2000 μg/kg，牛肝500 μg/kg，牛肾 500 μg/kg)。为保障动物源性产品食用安全性，保障消费者的身体健康，加强动物性食品中的氨丙啉残留的监测和检验工作，建立一种简单快速、灵敏度高的氨丙啉残留检测方法已是刻不容缓。对饲料、畜产品和其他样品中氨丙啉的检测，国内外已经应用的主要是高效液相色谱法(HPLC)［2－4］、液相色谱—质谱法(LC/MS)［3－7］等方法。本研究建立了牛肌肉、肝、肾以及牛脂肪中氨丙啉残留的高效液相色谱方法，为该药物残留监控提供了一种灵敏、高效、简便的检测技术。

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂 盐酸氨丙啉对照品，含量99.9%，批号 H0030811，购自中国兽医药品监察所。Waters 2695高效液相色谱仪(配2487型紫外检测器);XS－205电子天平(Mettler公司);SL502 N电子天平(上海民桥精密科学仪器公司):3k30型冷冻离心机(Sigma公司);20通道固相萃取装置(Waters公司);MS2 minishaker涡旋混匀器(IKA公司);Waters HLB固相萃取小柱(500 mg，6 cc);乙腈、甲醇为色谱纯;庚烷磺酸钠为高效液相色谱专用试剂;冰醋酸、三乙胺为分析纯。

1.2 溶液配制 标准贮备液:精密称取适量的盐酸氨丙啉对照品，用甲醇溶解并定容，配制成含氨丙啉100 μg/mL的贮备液，密封，－20℃保存。磷酸盐缓冲液:取磷酸二氢钾13.6 g，加水溶解后并稀释至1 L，用氢氧化钠溶液(5 mol/L)调节pH值至7.0。庚烷磺酸钠溶液:取庚烷磺酸钠1.2 g加水至1000 mL，再加冰醋酸24 mL，三乙胺6 mL，混匀。

1.3 色谱条件色谱柱为Waters XTerraR○MS C18色谱柱，4.6 mm ×250 mm，粒径 5 μm;进样量20 μL;流动相为庚烷磺酸钠溶液 －甲醇 －乙腈(60 ∶35 ∶5，V/V);流速 1.0 mL/min;柱温 30 ℃;检测波长267 nm。

1.4 标准曲线的绘制 精密量取氨丙啉标准贮备液，用流动相稀释成浓度为 0.20 ～20.0 μg/mL 的标准系列工作溶液，供高效液相色谱分析。以氨丙啉的峰面积为纵坐标，以氨丙啉浓度为横坐标，绘制标准曲线，求标准曲线方程和相关系数。

1.5 样品前处理

1.5.1 提取 称取(5±0.05)g试料于50 mL离心管中，加入乙腈10 mL，以10000 r/min速度匀质1 min，再以5000 r/min离心5 min，收集上清液。残渣中再加入乙腈10 mL，同样步骤操作后合并上清液，加入正丙醇5 mL，在50℃水浴中旋转浓缩至干，用20.0 mL磷酸盐缓冲液溶解残渣，作为备用液。

1.5.2 净化 HLB固相萃取柱依次用5 mL甲醇、5 mL水活化，准确量取1.5.1项中备用液5～10 mL过柱，用5 mL水淋洗，挤干。用4.0 mL流动相洗脱，挤干，收集洗脱液，混匀，过滤膜后供高效液相色谱分析。

1.6 方法准确度和精密度 采用标准添加法，在空白脂肪中添加定量限、1/2MRL、MRL、2MRL四个不同浓度的氨丙啉进行回收率试验;在空白肝脏、空白肌肉、空白肾脏中添加1/2MRL、MRL、2MRL、4MRL四个不同浓度的氨丙啉进行回收率试验，各浓度进行5个样品平行试验，重复3次以上，求批内、批间相对标准偏差。

2 结果与讨论

2.1 线性关系 在浓度0.20～20.0 μg/mL的范围内，氨丙啉的峰面积与其浓度呈线性关系，且线性关系良好，线性回归方程为y=39655x－2459.1，相关系数r2为0.9999，线性回归图见图1。

图1 氨丙啉标准曲线线性回归图

2.2 色谱条件的优化 本实验先后使用了Waters XTerraR○MSC18色谱柱(250 mm×4.6 mm，粒径5 μm)和 Waters Symmtry C18色谱柱(250 mm ×4.6 mm，粒径5 μm)，对不同流动相组成的分离效果进行了试验，均出现主峰保留时间过短、易与杂质峰混在一起的现象，或响应值较低导致灵敏度降低。而当流动相组成中添加离子对试剂，如庚烷磺酸钠溶液时，峰形较好，灵敏度较高，能与杂质峰完全分离。适当提高庚烷磺酸钠浓度和三乙胺的量可减小盐酸氨丙啉峰的拖尾因子，改善峰形，但峰宽会变宽，灵敏度降低。经反复试验、调整，最后选定流动相为庚烷磺酸钠溶液(庚烷磺酸钠1.2 g加水至1000 mL，再加冰醋酸24 mL，三乙胺6 mL)－甲醇－乙腈(60∶35∶5，V/V)，此时目标物与杂质能很好的分离，且峰形较好。

2.3 样品的提取与净化 本方法采用乙腈、磷酸盐缓冲液分别对样品进行提取。并在样品量5 g(牛脂肪、牛肾脏)的前提下对提取条件进行了优化。优化时氨丙林在牛脂肪、牛肾脏的添加浓度均为1000 μg/kg，考虑到尽量减少有机溶剂用量和节约时间，本方法采用两次提取，每次提取溶液用量10 mL进行实验，结果表明，乙腈对样品进行提取都得到了较好的回收率，用磷酸盐缓冲液，由于提取后特别是牛肾脏组织，较为浑浊，无法过SPE柱进行净化。

2.4 固相萃取条件的选择 考虑到氨丙啉的理化性质，采用C18、WCX柱和HLB柱固相萃取小柱，对牛脂肪1000 μg/kg添加做了回收率试验，根据各自的最佳条件考察除杂质效果和回收率，经过反复试验比较，选择HLB柱作为牛组织中氨丙啉残留测定的净化柱，可以达到较好的净化目的，且过柱回收率在80%以上。分别用甲醇5 mL，水5 mL充分活化HLB柱，准确移取5.0～10.0 mL备用液上柱，控制过柱速度在1 mL/min以内。用水5 mL淋洗HLB固相萃取柱，挤干HLB柱，用流动相4.0 mL洗脱;另取4 mL流动相重复一次，同法检测未发现氨丙啉，说明4.0 mL流动相可以将吸附在柱子上的氨丙啉完全洗脱下来。

2.5 检测限和定量限 本方法称取6份空白组织，按照1.5项下步骤处理后，测得基线噪音值，求其平均值，按信噪比S/N=3为检测限，S/N=10为定量限，求得在牛的脂肪，肌肉、肝脏和肾脏中的检测限为 100 μg/kg，定量限为 250 μg/kg，均低于国家规定的牛组织中的最高残留限量要求，表明该方法可行，完全能满足残留分析要求。

2.6 准确度和精密度 在牛脂肪中添加浓度为200、1000、2000 和4000 μg/kg，在牛肌肉、肝和肾中添加浓度为250、500、1000 和2000 μg/kg 进行添加回收率试验。牛肉、牛肝、牛肾在250～2000 μg/kg添加浓度范围内，回收率为60% ～110%;牛脂肪在200～4000 μg/kg添加浓度范围内，回收率为70% ～110%，批内RSD＜15%，批间RSD＜15%。结果见表1，氨丙啉标准溶液色谱图见图2，各组织的添加色谱图选取牛脂肪空白、添加氨丙啉的色谱图(图3、图4)为代表。

表1 空白牛组织中氨丙啉添加回收率试验结果

续表

图4 空白牛脂肪添加试样(1000 μg/kg)的色谱图

3 结论

本研究建立了氨丙啉残留方法，采用乙腈提取，用HLB固相萃取小柱净化，提取效果好，回收率在60%以上。在牛的脂肪、肌肉、肝脏和肾脏中的检测限为100 μg/kg，在牛的肌肉、肝脏、肾脏中定量限为 250 μg/kg，在牛的脂肪中定量限为200 μg/kg。批内 RSD ＜15%，批间 RSD＜15%。此方法可以为该药物的监控提供技术支持和保障，保证国际之间正常贸易往来、保障人类健康，具有十分重要的意义和实用价值。

［1］中华人民共和国农业部公告第235号公告［Z］.动物性食品中兽药最高残留限量，2002.

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