Importin 13在子宫内膜异位症和子宫内膜癌中的表达及意义

龙行涛 王冬 田桂兰 胡建国

1.重庆市肿瘤研究所，重庆市肿瘤医院妇瘤科，重庆 400030；2.重庆医科大学附属第二医院妇产科，重庆 400010

Importin 13在子宫内膜异位症和子宫内膜癌中的表达及意义

龙行涛1王冬1田桂兰1胡建国2

1.重庆市肿瘤研究所，重庆市肿瘤医院妇瘤科，重庆 400030；2.重庆医科大学附属第二医院妇产科，重庆 400010

背景与目的：正常情况下的子宫内膜干/祖细胞有助于子宫内膜的生理性修复，而子宫内膜干/祖细胞的异常增殖和异常分化则会导致子宫内膜疾病(如子宫内膜异位症和子宫内膜癌)。Importin 13(IPO13)是importin β家族新成员的一个核质双向的转运受体蛋白，是角膜上皮干细胞的一个标记，在维持干细胞的性状、高增殖潜力、低分化状态，调节细胞分化以及小鼠生殖细胞减数分裂上具有重要的作用。本文探讨成体干细胞标记IPO13在子宫内膜异位症和子宫内膜癌中的表达及意义。方法：手术取正常子宫内膜组织40例(对照组)，其中增生期和分泌期各20例，异位子宫内膜组织20例(异位症组)和子宫内膜癌病灶组织20例(内膜癌组)。采用免疫组化SP法检测IPO13蛋白在细胞内的定位；采用实时荧光定量PCR技术(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)检测IPO13 mRNA的表达；Western blot检测IPO13蛋白的表达。结果：IPO13蛋白在内膜癌、异位症及正常对照组中腺上皮细胞和间质细胞的细胞质和细胞核中均有表达。IPO13蛋白在对照组增生期表达量(0.52±0.30)明显高于分泌期(0.25±0.04，P＜0.05)；IPO13蛋白在异位症组表达量(0.81±0.12)明显高于对照组增生期及分泌期(P＜0.05)；IPO13蛋白在内膜癌组表达量(1.21±0.11)明显高于异位症组(P＜0.05)。IPO13 mRNA在对照组增生期表达量是分泌期的3倍(P＜0.05)；IPO13 mRNA在异位症组中表达量是对照组分泌期的6倍(P＜0.05)，增生期的2.5倍(P＜0.05)；IPO13 mRNA在内膜癌组表达量是异位症组的2倍(P＜0.05)。结论：IPO13在子宫内膜癌中及异位症组中表达明显高于对照组，推测其高表达与子宫内膜癌及子宫内膜异位症发病密切相关。

子宫内膜异位症； 子宫内膜癌； Importin 13； 子宫内膜干细胞

近年来研究认为，正常情况下的子宫内膜干/祖细胞有助于子宫内膜的生理性修复，而子宫内膜干/祖细胞的异常增殖和异常分化则会导致子宫内膜疾病(如子宫内膜异位症和子宫内膜癌)［1-2］。Importin 13(IPO13)是importin β家族新成员的一个核质双向的转运受体蛋白，是角膜上皮干细胞的一个标记，在维持干细胞的性状、高增殖潜力、低分化状态，调节细胞分化以及小鼠生殖细胞减数分裂上具有重要的作用［3-5］。本研究拟采用免疫组化、荧光定量PCR技术(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)以及免疫印迹的方法检测IPO13在子宫内膜异位症和子宫内膜癌患者内膜中的表达，探讨其与子宫内膜异位症和子宫内膜癌发生、发展的关系及意义。

1 资料和方法

1.1 研究对象

随机选取重庆市肿瘤医院2010年7月—2011年4月开腹或者腹腔镜手术治疗的卵巢子宫内膜异位囊肿、子宫内膜癌和其他非激素依耐性良性内膜疾病做宫腔镜检查的患者。征得重庆市肿瘤医院伦理委员会通过并与患者达成协议，于手术时取异位子宫内膜组织20例(异位症组)和子宫内膜癌病灶组织20例(内膜癌组)。正常子宫内膜采用美国史赛克公司5.07 mm连续灌流宫腔检查及治疗镜，取正常子宫内膜40例(增生期和分泌期各20例，对照组)，子宫内膜组织各约0.5～1.0 g。以上各组患者在年龄等因素中具有可比性(P>0.05)。所有患者月经周期均规律，术前3个月未接受激素治疗，未妊娠及哺乳。经组织病理学检查证实，排除了合并子宫腺肌病、功血、多囊卵巢综合征等其他激素依赖性疾病患者。

1.2 实验方法

1.2.1 IPO13细胞内定位

4%甲醛固定组织标本，常规石蜡包埋，组织切片厚4 μm，HE染色后镜下观察到典型子宫内膜组织者为入选标本。山羊抗人IPO13(NB100-1369，稀释度1∶100)多克隆抗体(Novus Biologicals)，免疫组化步骤按免疫组化SP试剂盒说明书操作，二氨基联苯胺(DAB)显色。阳性结果判定标准：光镜下每张切片选取5个有代表性高倍镜视野，计数1 000个细胞，计算阳性细胞百分率。阴性为染色细胞数<5%，阳性为染色细胞数>5%。其中弱阳性为染色细胞数≤25%；强阳性为阳性染色细胞数>50%)［6］。

1.2.2 荧光定量RT-PCR检测IPO13 mRNA的表达

用TRIzol(GIBCO公司)抽提组织总RNA，逆转录，PCR扩增IPO13，并扩增β-actin作为内参物，逆转录试剂盒和RNA提取试剂购自宝生物工程(大连)有限公司。β-actin和IPO13引物以及荧光定量PCR试剂盒购于广州复能基因有限公司(货号分别为：Hs-QRP-20056、Hs-QRP-20468)。反应条件：预变性 95 ℃10 min，95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，重复40个循环。阴性对照以无RNA酶的水代替cDNA模板，每例样品及对照均设3个平行复孔，取平均值。反应结束后，由软件自动得出荧光反应曲线以及每个标本反应体系的扩增效率及CT值，实验不同时间重复6次。

1.2.3 IPO13蛋白检测

裂解组织以每孔25 μg上样，行聚丙烯酰胺凝胶电泳，电转移至PVDF膜，依次加入山羊抗人IPO13多克隆抗体(稀释度1∶500)和辣根过氧化酶物标记驴抗羊IgG，化学荧光发光法(ECL)显影(碧云天公司)。操作过程按说明书进行。用凝胶成像系统成像，对结果进行灰度扫描分析，相对表达量以IPO13灰度面积积分分别与内参的比值计算。

1.3 统计学处理

统计分析运用SPSS 11.5软件，实验数据为正态分布，所有数据方差具有齐同性，采用独立样本t检验进行比较分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 免疫组化结果

IPO13蛋白在内膜癌、异位症及正常对照组中子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞的细胞质和细胞核中均有表达，主要表达于上皮细胞中(图1)。

2.2 IPO13 mRNA在各组内膜中表达

IPO13 mRNA在对照组增生期表达量是分泌期的3倍(P<0.05)；在异位症组中表达量是对照组分泌期的6倍(P<0.05)，增生期的2.5倍(P<0.05)；在内膜癌组表达量是对照组增生期的4倍(P<0.05)，分泌期的约10倍(P<0.05)，异位症组的2倍(P<0.05，图2)。

2.3 IPO13蛋白定量的检测

IPO13蛋白在对照组增生期、分泌期、异位症和内膜癌组中的表达率均为100%，表达量分别为0.52±0.30、0.25±0.04、0.81±0.12和1.21±0.11。对照组增生期IPO13蛋白的表达量显著高于分泌期(P<0.05)；异位症组IPO13蛋白表达量均高于对照组分泌期及增生期(P<0.05)；内膜癌组IPO13蛋白表达量均高于对照组分泌期及增生期也显著高于异位症组(P均<0.05，图3)。

3 讨 论

IPO13是目前所知的哺乳动物细胞中唯一具有双向转运功能的受体蛋白［4］。另外研究还发现，IPO13的表达受到糖皮质激素和机体发育期的双重调控，IPO13能够转运pax-6、pax-3、ubc9、MGN、RBM8、ElF1A、糖皮质激素受体和肌足蛋白，并且IPO13和这些蛋白相互作用，精确地调控胚胎脑、肺和心脏的发育［3，5，7-10］。在角膜上皮干细胞中，IPO13对保持角膜缘干细胞的性状、高增殖潜力、低分化状态具有重要的作用。本研究显示，在子宫内膜癌及异位内膜组织中IPO13 mRNA转录以及蛋白翻译水平存在明显上调。

子宫内膜异位症是一种良性疾病，但却具有浸润、广泛种植和易复发等与恶性肿瘤相似的一些生物学特征［11］。因此，传统的观点认为子宫内膜异位症是一种类癌疾病。近年来研究认为，子宫内膜疾病是子宫内膜干/祖细胞增殖分化异常引起的［1，12］，异位内膜组织中干细胞相关基因TCL1、UTF1和SALL4比正常内膜表达增加［12］，调控干细胞增值分化的c-kit在异位内膜中表达也上调［13］。子宫内膜异位症病灶虽为多中心起源，但每一局部病灶细胞呈明显克隆性，而具有克隆能力是干细胞特征之一，提示子宫内膜异位症病灶可能是干细胞。IPO13在维持成体干细胞的“干性”、调控干细胞克隆形成和增殖分化中具有重要作用［4］。本研究发现，异位症组IPO13表达较对照组增生期及分泌期内膜显著上调，这可能是异位内膜中子宫内膜干/祖细胞增殖分化异常引起的。因此，本研究推测IPO13/干细胞因子轴在子宫内膜异位症的发病中具有重要的意义，高表达IPO13蛋白可能与子宫内膜异位症的浸润、复发相关。

Gargett等［14］通过对子宫内膜上皮和基质细胞克隆形成能力的鉴定证实子宫内膜干细胞的存在。在子宫内膜癌中，维持成体干细胞“干性”的Wnt/β-catenin和PTEN信号通路表达异常，端粒酶表达和活性增加也说明子宫内膜癌是一种干细胞疾病［12，15］。肿瘤细胞和干细胞一样，具有自我更新和高增殖活性［16-17］。本研究发现，在子宫内膜癌中IPO13从转录水平到蛋白表达水平显著上调，其表达显著高于对照组及内膜异位症组。因此，IPO13可能与子宫内膜癌的发病、恶性进展密切相关。在子宫内膜癌中，可能受IPO13异常调节作用而发生了核质转运异常，但具体调节机制目前仍然不清楚，需进一步研究。但本研究为从调控子宫内膜干/祖细胞的增殖和分化的视角研究内膜癌发病机制奠定了相关理论基础。

综上所述，子宫内膜异位症和子宫内膜癌的发生是多基因多步骤综合作用的结果。IPO13是调控干细胞增殖分化中的蛋白，在调节细胞增殖分化中具有重要的作用。IPO13可能参与了内膜异位症和内膜癌中子宫内膜干/祖细胞的异常增殖和分化的调控，其异常高表达有促进子宫内膜/干祖细胞异常增殖和异常分化的作用。目前临床上对于子宫内膜异位症的治疗还停留在手术和调控体内激素分泌上。因此，从调控子宫内膜干/祖细胞的增殖和分化的视角去研究子宫内膜异位症和子宫内膜癌的发病机制和治疗，还有待于进一步深入。

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The expression and significance of importin 13 in endometriosis and endometrial carcinoma

LONG Xing-tao, WANG Dong, TIAN Gui-Lan, HU Jian-guo(Department of Gynecologic Oncology,Chongqing Cancer Hospital, Chongqing Tumor Institute, Chongqing 400030, China)

WANG Dong E-mail：cqwindow120@163.com

Background and purpose：Human uterine stem/progenitor cells activity contributes to the physiological endometrial repair, but abnormal proliferation and abnormal differentiation of uterine stem/progenitor cells will lead to endometrial disease (such as endometriosis and endometrial carcinoma). Importin 13 (IPO13) is the new family member of importin β, a two-way transfer of nuclear receptor proteins and a marker of corneal epithelial stem cells. In the maintenance of stem cells, high proliferative potential and poorly differentiated state play important roles in regulating normal and abnormal of cell differentiation and mouse germ cells meiosis. The study investigated the expression ofIPO13gene, an adult stem cell marker, in endometriosis and endometrial carcinoma tissues for the purpose of finding the relationship between this gene and endometriosis and endometrial carcinoma.Methods：The expression of IPO13 in normal endometrial tissues, endometriosis tissues and endometrial carcinoma tissues was detected by the immunohistochemistry, real-time PCR and Western blot respectively.Results：In endometrial carcinoma, endometriosis and control groups, the expression of IPO13 protein was found in cytoplasm and nucleus of epithelial cells and stromal cells. The expression level of IPO13 protein in normal proliferative phase endometrium was 0.52±0.30, significantly higher than that in normal secretory phase (0.25±0.04,P＜0.05); IPO13 protein in the ectopic endometrium was 0.81±0.12, significantly higher than that in proliferative phase and secretory phase endometria(P＜0.05); IPO13 protein in the endometrial carcinoma was 1.21±0.11, significantly higher than that in the ectopic endometrium (P＜0.05). The expression level of IPO13 mRNA in normal proliferative phase endometrium was 3 times higher than that in normal secretory phase (P＜0.05); IPO13 mRNA in the ectopic endometrium was 2.5 times higher than that in normal proliferative phase endometrium and 6 times higher than that in normal secretory phase endometrium(P＜0.05); IPO13 mRNA in the endometrial carcinoma were 2 times higher than that in the ectopic endometrium (P＜0.05).Conclusion：The expression of IPO13 in endometrial carcinoma and endometriosis is increased, which suggests IPO13 is closely related with endometrial cancer and endometriosis.

Endometriosis; Endometrial carcinoma; Importin 13; Endometrial stem cells

10.3969/j.issn.1007-3969.2012.01.003

R737.33

A

1007-3639(2012)01-0010-05

重庆市卫生局课题资助(NO：08-2-284)。

王冬 E-mail:cqwindow120@163.com

2011-07-20

2011-11-07）