上皮间质转化与乳腺癌的研究进展

屈洪波 综述 吴诚义 审校

重庆医科大学附属第一医院内分泌外科，重庆 400016

上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT) 是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的生物学过程。EMT使上皮细胞失去了细胞极性及与基底膜连接等上皮表型特征，而获得高迁移、侵袭、抗凋亡及降解细胞外基质等间质表型特征。EMT的肿瘤干细胞特征对常规化疗更具抵抗性，因此，深入探讨恶性肿瘤发生EMT的分子机制，将为靶向EMT关键分子的治疗研究提供新的理论依据。

1 EMT相关标志物与乳腺癌

乳腺癌细胞系全基因组转录谱的鉴定结果显示，EMT相关标志物的表达与其侵袭转移显著相关［1-2］。研究表明，基底型乳腺癌更易发生EMT，具有更高的侵袭转移能力［3］。从骨髓微转移灶分离的乳腺癌细胞也显示与侵袭转移相关的EMT特征［4］。研究还发现，在原发性乳腺癌中常出现细胞角蛋白缺失，这与EMT在促使癌细胞扩散至周围基质的机制相一致［4］。

EMT的一个重要特征是同种表型细胞黏附分子的缺失。E-钙黏蛋白是维持上皮表型的重要黏附分子，其功能缺失在诱导乳腺良性病变进展为恶性病变过程中发挥关键作用。E-钙黏蛋白部分缺失或完全缺失与肿瘤低分化、高侵袭力及临床预后差密切相关［5］。E-钙黏蛋白维持正常组织结构和上皮细胞行为是基于不同的调控机制，而这些机制在乳腺癌中表现为失功能，尽管E-钙黏蛋白CDH1基因位点缺失和伴随的杂合性缺失在维持乳腺小叶癌基因沉默中发挥重要作用［5］，但是EMT的发生主要与转录水平上E-钙黏蛋白下调有关，这可能是由CDH1启动子超甲基化或转录抑制所致［6］。事实上，乳腺导管癌中存在不同程度E-钙黏蛋白缺失，表明在乳腺癌侵袭早期，组织微环境即有E-钙黏蛋白转录水平的短暂下调［5］。

研究还表明，E-钙黏蛋白的表达下调能够明显增强乳腺癌侵袭转移能力［7］，而给予外源性E-钙黏蛋白尽管并不足以使间质细胞表型逆转，但能够抑制乳腺癌转移［8-9］。

E-钙黏蛋白在EMT中具有细胞黏附及信号转导的双重作用。首先，E-钙黏蛋白缺失将造成细胞间黏附下降，致使细胞连接松散；其次，E-钙黏蛋白缺失可促使β-连环蛋白迁移至细胞膜，进而激活Wnt信号通路和EMT相关的下游信号通路，进一步诱导自身转录抑制因子产生，如TWIST，ZEB1互反馈环路。

除E-钙黏蛋白表达缺失外，细胞间黏附连接的完整性也受到连环蛋白下调的影响，连环蛋白通过分子桥连接到E-钙黏蛋白及肌动蛋白骨架上；研究发现紧密连接、桥粒及上皮细胞极性相关基因在EMT过程中同时被下调，导致细胞间连接松散和极性消失［10-11］。E-钙黏蛋白在EMT中下调，通常与“钙黏连蛋白转换”相关，最终诱导产生非上皮性钙黏蛋白产生，如N-钙黏蛋白。间质细胞高表达N-钙黏蛋白与乳腺癌侵袭转移及临床预后较差相关［12］。

波形蛋白(Vimentin)被认为是间质细胞的另一种重要标志物，在维持间质特征中发挥作用。研究证实，体外培养的上皮细胞早期通常表达Vimentin以适应培养环境，Vimentin的高表达与多个乳腺癌细胞系的侵袭、转移及EMT相关，被认为与其他间质标志物共同发挥调节作用，如细胞外基质Tenascin C。尽管基于E-钙黏蛋白下调的机制已基本明确，但EMT过程中如何诱导Vimentin表达的分子机制仍不清楚。研究证实，乳腺癌细胞β-连环蛋白/淋巴细胞增强因子-1途径介导Vimentin表达，这与β-连环蛋白激活后E-钙黏蛋白缺失相一致［13］。最近研究证实，Vimentin的表达是EMT晚期事件，表明基因调控的暂时性和上皮细胞表型缺失先于间质表型获得［14］。ZEB2/SIP1在EMT中，以一种独立于β-连环蛋白的形式间接促进Vimentin表达［14］，表明在诱导EMT相关Vimentin的表达中存在不为人知的转录激活因子。

另一个间质标志物FSP1/S100A4被认为是诱导EMT发生的早期事件，其表达水平与乳腺癌恶性进展相关。在乳腺癌小鼠模型中，证实FSP1/S100A4作为EMT标志物在启动乳腺癌转移中发挥重要作用［15］。

2 EMT相关转录因子与乳腺癌

以往研究证实，多个相互关联的信号转导通路和胞外信号分子协同参与乳腺癌EMT调节［1］。EMT通过诱导乳腺癌外在细胞因子，如肿瘤坏死因子-α (TNF-α)，转化生长因子-β (TGF-β)、血小板源性生长因子(PDGF)、肝细胞生长因子(HGF)及碱性成纤维生长因子(bFGF)，结合相应受体，从而激活胞内效应子，如Ras、NF-κB、Smads、β-连环蛋白及整合素等。同时，EMT也能被细胞外基质成分诱导，通过分泌基质金属蛋白酶(MMPs)来完成细胞外基质重塑［1］。

另外，通过诱导螺旋-环-螺旋转录因子，如TWIST、SNAIL1/2、ZEB1、ZEB1/SIP1、GOOSECOID及FOXC2等的激活，最终下调上皮性标志物表达，促进间质表型获得。大量的研究证实，乳腺癌中多个EMT转录因子的上调与临床预后较差直接相关［1,16-19］，如SNAIL过表达与乳腺浸润性导管癌低分化、淋巴结转移相关［16］，TWIST高表达与侵袭性小叶癌相关，GOOSECOID高表达与乳腺导管癌相关［17］。

在人表皮生长因子受体-2 (Her-2)诱导的乳腺癌小鼠模型中，证实肿瘤复发与EMT中SNAIL上调有关［18］，SLUG高表达与乳腺癌临床预后差相关［19］。ZEB1上调与乳腺侵袭性导管癌及未分化小叶癌上皮去分化相关，同时发现ZEB1在肿瘤相关间质细胞中也存在高表达。但是有关肿瘤相关间质细胞是否来源于EMT过程中ZEB1诱导的肿瘤细胞，有待进一步实验验证。

3 EMT与乳腺癌微环境的相互应答

在乳腺癌进展中，胚胎性转录因子再表达可能是由于遗传的不稳定性或局部组织微环境的交互作用。支持前者的研究发现小鼠乳腺Singleminded-2s的缺失，其通过SLUG诱导EMT发生，揭示了在成体乳腺中基因失活能够促使EMT发生［20］。而支持后者的研究，发现低氧环境下，SNAIL及SLUG异常表达及向胞核聚集，阐明低氧微环境在介导EMT发生的作用机制［21-22］。

尽管在肿瘤进展早期，组织微环境对于肿瘤发展是不利的，但随着肿瘤进展，其可有效阻断来源于宿主的细胞毒信号产生，促使炎性反应，通过募集肿瘤浸润的淋巴细胞以适应宿主反应，而这些肿瘤细胞、周围基质与炎性细胞之间的相互应答，通过分泌MMPs、ECM、生长因子及细胞因子从而诱导局部组织重塑，导致EMT发生及侵袭转移。在乳腺癌细胞与巨噬细胞共培养实验中，证实NF-κB介导的SNAIL途径能够诱导EMT发生，并增强了乳腺癌迁移及侵袭能力［23］。

以上的观点同样也适于间质上皮转化(mesenchymal-epithelial transition，MET)。一开始肿瘤细胞通过诱导EMT发生从而适应炎性微环境，而当处于非炎性微环境的远处转移灶时，可诱导EMT部分逆转及MET。通常侵袭性乳腺癌原发灶显示间质特征，而远处转移灶显示上皮特征。

尽管位于上皮细胞附近的成纤维细胞的修饰作用在许多肿瘤模型中被证实，然而有关成纤维细胞来源的问题仍存在争议。EMT的一种潜在机制是肿瘤细胞调控源于上皮细胞的间质。Petersen等［24］认为乳腺癌能够通过EMT产生针对自身的非恶性间质，反过来促进原发肿瘤的生长。

4 EMT赋予乳腺癌干细胞特征

最近，Mani等［25］证实具有迁移侵袭能力的乳腺癌细胞EMT化后获得了干细胞样潜能。CD44+/CD24-/low乳腺癌细胞表型被定义为富集了干细胞样特征的乳腺癌干细胞亚群，即具有自我更新能力及多向分化能力［26］。因此，永生化的人乳腺上皮细胞在不同的EMT诱导因子作用下可获得自我更新能力及CD44+/CD24-/low表型。反之，从乳腺癌组织中分离的癌干细胞高表达间质标志物。Morel等［27］发现Ras/MAPK通路的异常激活不但能诱导CD44+/CD24-/low亚群和EMT混合表型产生，而且低氧诱导SLUG的活化与基底样乳腺癌表型获得及干细胞相关基因表达明显相关，如CD133及BMI-1。Hennessy等［28］通过体内实验发现， CD8T细胞诱导EMT发生，获得的间质肿瘤细胞具有干细胞特征，再次表明异常炎性反应可促进乳腺癌进展，同时基因组转录谱显示化生性、低黏附性乳腺癌细胞也具有EMT及干细胞样特征。综上所述，不同乳腺癌细胞系可通过EMT获得干细胞样特征，EMT不仅有利于肿瘤细胞脱离原发灶，也促进继发性肿瘤产生。

目前有关癌干细胞特征与EMT之间的分子机制仍未完全清楚。Dimeo等［29］在乳腺癌小鼠肺转移模型中，通过LRP6抑制Wnt信号通路能减少癌干细胞产生及逆转EMT，从而恢复上皮细胞表型、抑制SLUG及TWIST表达。随着多个与Wnt信号通路相关组分在调控乳腺癌肺转移的机制被证实，表明靶向Wnt信号通路对于控制EMT相关的乳腺癌复发及转移具有重要意义。

5 EMT、癌干细胞样特征与化疗抵抗性

EMT及干细胞潜能获得对乳腺癌研究具有重要意义。乳腺癌细胞在经历EMT后具有更强生存能力及耐药性。体外实验发现TWIST能够通过依赖于P53和Rb信号通路对抗癌基因诱导的细胞凋亡［30］及细胞衰老［31］，多柔比星能够诱导乳腺癌MCF-7细胞系TWIST表达，介导EMT发生、多药耐药及肿瘤侵袭性。进一步体内异种移植瘤实验证实，小干扰RNA介导的TWIST沉默能明显下调多柔比星化疗抵抗性及降低P53活性［32］。

SNAIL通过在转录水平上抑制多个促凋亡基因从而产生抗凋亡作用。因此，除了诱导EMT发生及增强细胞侵袭外，SNAIL家族成员具有对抗多柔比星诱导的细胞凋亡作用。反之，通过RNA干扰沉默SNAIL基因可逆转多柔比星耐药性［33］，而SNAil及TWIST介导的EMT在TrkB诱导的细胞凋亡抑制途径中发挥重要作用［34］。因此，EMT能够使乳腺癌细胞在脱离基底膜环境下继续生存，最终促进肿瘤转移及扩散。

在哺乳动物的研究发现，YB-1基因可能在调控EMT相关的转录因子网络中发挥重要作用。例如，SNAIL、ZEB/SIP1等蛋白具有诱导间质表型获得和介导肿瘤侵袭转移的能力。YB-1不仅参与EMT调控，还抑制增殖相关基因表达，因而具有抗增殖活性。总之，YB-1基因的激活使癌细胞获得转移能力的同时进入休眠状态。过表达YB-1的细胞显示干细胞样特征，如低增殖，表达干细胞标志物P63、CD44、CD10的上调和CD24的下调［35］，表明YB-1可能并不受细胞分裂期药物的影响，而靶向YB-1很可能刺激转移细胞增殖。因此，作为EMT下游调控因子的YB-1将是一种有效的治疗靶点。

癌灶中大部分处于增殖期细胞能被化疗药物消灭，然而仍有小部分表达CD44+/CD24-/low癌干细胞亚群似乎对化疗有内在抵抗性，并具有促使肿瘤复发及乳腺球形成的能力［36］。最近，通过检测内分泌治疗及化疗后残存乳腺癌细胞亚群基因表达谱，结果显示残存的乳腺癌细胞具有EMT特征、癌干细胞潜能及化疗抵抗性，同时相应基因表达谱也发现残留细胞具有肿瘤起始细胞及间质特征［37］。

总之，EMT与癌干细胞间的转化最终使癌细胞获得了化疗抵抗性及抗凋亡能力，细胞进入休眠状态以逃避细胞毒性药物的杀伤作用。有人提出假设，化疗可促使肿瘤以一个更具侵袭的模式参与复发转移，同时表明抑制或逆转EMT能够改善乳腺癌化疗效果。

6 结语

综上所述，EMT不仅赋予乳腺癌细胞侵袭、转移特征，而且赋予化疗抵抗性及癌干细胞样特征。EMT、化疗抵抗性及癌干细胞之间的交互作用促使人们设想开发针对EMT的靶向药物。通过药物抑制EMT发生或MET促使癌干细胞向一种高分化上皮表型分化，从而诱导细胞发生凋亡及提高对常规化疗敏感性。因此，靶向EMT可能是一种有效的治疗途径，抑制EMT不仅能抑制肿瘤侵袭转移，而且能抑制癌干细胞生成。目前在多种肿瘤中发现参与调节EMT的多个信号通路也参与对癌干细胞自我更新的调节，故靶向EMT和癌干细胞共同信号通路将是一种新的治疗策略。

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