miR-10b与乳腺癌侵袭及预后的相关性研究

宋传贵 傅芳萌 吴雪英 韩忠华 王川

福建医科大学附属协和医院乳腺外科，福建 福州 350001

miR-10b与乳腺癌侵袭及预后的相关性研究

宋传贵 傅芳萌 吴雪英 韩忠华 王川

福建医科大学附属协和医院乳腺外科，福建 福州 350001

背景与目的：miR-10b通过增加其下游转移基因RHOC的表达，影响肿瘤的转移和侵袭能力。本研究探讨miR-10b在乳腺癌石蜡组织中的表达及其与乳腺癌侵袭转移及预后的关系。方法：采用实时定量PCR(real-time qPCR)对60例乳腺癌患者原发肿瘤蜡块提取的RNA进行miR-10b表达水平的测定，Mann Whitney-U非参数检验比较miR-10b表达水平和乳腺癌临床病理参数的关系，预后分析采用Kaplan-Meier生存分析和log-rank计算。结果：miR-10b表达水平与乳腺肿瘤的大小、淋巴结转移、组织学分级、激素受体状态、肿瘤病理分期、组织类型及是否复发等无明显关系(P＞0.05)。Kaplan-Meier生存分析表明，miR-10b表达水平并不影响乳腺癌患者的生存期(P=0.485)。结论：miR-10b表达在乳腺癌侵袭转移中的作用有限，并不是影响预后的主要因素，尚不足以作为基于石蜡组织标本的乳腺癌预测预后指标。

乳腺肿瘤； miR-10b； 转移； 预后； 石蜡包埋组织

Mi(cro)RNA是一类小片段非编码RNA分子，通过对靶mRNA降解、翻译抑制调控癌或抑癌基因的表达，参与肿瘤的发生、发展。miRNA在肿瘤细胞中表达水平的异常是肿瘤发生、发展的重要影响因素［1］。miR-10b作为miRNA家族中的一员，在乳腺癌、肝癌、胰腺癌等肿瘤组织中均存在异常表达，并且与肿瘤的侵袭及远处转移有密切关系［2］。miRNA可以长期稳定保存在4%的甲醛溶液固定石蜡包埋(formalinfixation and paraffin-embedding，FFPE)的组织切片中，并可被高效抽提定量［3］。目前石蜡标本中miRNA表达水平的研究尚少，本研究选择可手术乳腺癌为研究对象，探讨miR-10b的表达与乳腺癌临床病理参数及预后的关系，确认其是否可以作为临床侵袭性及预后的预测指标。

1.2 方法

1 资料和法

1.1 临床资料

1.1.1 研究对象

选择福建医科大学附属协和医院2002年3月—2005年12月具有完整随访资料的非转移原发性乳腺癌患者60例，年龄31～92岁，中位年龄为(52.3±12.6)岁。全部经组织病理证实，随机抽取，排除新辅助化疗及晚期转移患者(表1)。患者接受规范化治疗，手术方式为改良根治术，术后辅助化疗采用FAC或AC-T方案，ER阳性患者予以内分泌治疗(他莫昔芬)，腋窝淋巴结转移≥4个或肿瘤直径≥5 cm者予以胸壁+锁骨上区放疗。

1.1.2 主要试剂和仪器

石蜡组织总RNA提取试剂盒(Recover AllTMTotal Nucleic Acid Isolation Kit)购自美国 ABI 公司；RT反转录试剂盒、SYBR-GreenⅠ荧光试剂盒(miRCURY LNATMUniversal RT microRNA PCR)购自丹麦Exiqon公司；hsa-miR-10引物、内参U6 snRNA由Exiqon公司合成。 酶标仪(DU-600型分光度计)为Beckman公司产品，Real-time PCR仪ABI7500为美国Ambion公司产品。

1.2.1 蜡块组织中提取RNA

将石蜡包埋的组织切成≥10 μm的薄片，取≤80 μm的石蜡组织，常规脱蜡，蛋白酶消化，操作按照ABI公司蜡块组织提取试剂盒说明书进行，离心柱洗脱出总RNA。检测RNA溶液D260/D280吸光值，计算RNA浓度和纯度，D260/D280比值介于1.8~2.1方可用于cDNA合成。2%琼脂糖变性凝胶电泳检测RNA的完整性。RNA存于-80 ℃备用。

1.2.2 cDNA合成

表 1 miR-10b表达水平与乳腺癌临床病理指标间的关系Tab. 1 Correlation of miR-10b level and clinico pathological parameters of breast cancer

所有模板RNA浓度调至40 ng/μL，5×Reaction buffer 4 μL+Enzyme mix 2 μL+Nuclease-free water 10 μL+Template total RNA 4 μL，共20 μL体系，反应条件为：42 ℃ 60 min，95 ℃ 5 min。

1.2.3 Real-time qPCR(实时荧光定量PCR)

反应在实时定量P C R仪上完成。以第一链c D N A为模板应用特定加尾结构的引物，m i R-1 0结构为：5’-UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG-3’。PCR扩增体系为：cDNA 8 μL，SYBR Green master mix 10 μL，PCR mix 2 μL共 20 μL；反应条件：94 ℃ 预变性5 min，94 ℃变性30 s，56 ℃延伸30 s，72 ℃退火45 s，共40个循环，72 ℃10 min 延伸；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s (建立溶解曲线)。

1.2.4 Ct值计算

记录每个反应管中的荧光信号到达所设定的阈值时所经历的循环数即Ct值，每例标本均加2个复孔检测，Ct值取平均数；采用定量PCR中的相对定量法，以U6 snRNA作为内参照，以2-ΔCt表示肿瘤组织目的基因的表达相对于内参照的变化倍数，其中ΔCt =(CtmiR-10b-CtU6)。

1.3 统计学处理

统计分析采用SPSS 17版软件。Mann-Whitney U检验比较miR-10b表达水平和乳腺癌临床病理参数关系，预后分析采用Kaplan-Meier生存分析和log-rank计算，所有统计采用双侧概率检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 miR-10b表达与乳腺癌临床病理因素的关系

所有蜡块组织重新切片，ER、PR及Her-2状态，脉管瘤栓，组织学分级等经过病理专家审核确定；分期根据AJCC乳腺癌TNM分期。复发患者包括局部复发和远处转移。经Mann-Whitney U非参数检验，在淋巴结转移、ER及PR阴性或Her-2高表达的高侵袭性乳腺癌中，并未发现miR-10b表达水平升高(P>0.05)；同时未发现其与肿瘤大小、组织学分级、肿瘤病理分期、组织类型及肿瘤复发之间存在明显相关性(表1)。

2.2 miR-10b表达与乳腺癌预后的关系

以平均值2-ΔCt=21.46作为截断值，将miR-10b水平分为高表达组(2-ΔCt>21.46)及低表达组(2-ΔCt<21.46)，Kaplan-Meier生存分析表明，miR-10b表达水平高低并不影响乳腺癌预后，总生存率log-rank分析结果见图1(χ2=0.488，P=0.485)；无复发生存率log-rank分析结果见图2(χ2=0.108，P=0.743)。

3 讨 论

Ma等［4］在体外乳腺癌细胞系的研究表明，miR-10b表达可以促进细胞侵袭，阻断miR-10b，侵袭性较强的乳腺癌细胞侵袭力明显下降；miR-10b主要在转移性乳腺癌细胞中表达升高，而并非原发肿瘤细胞。本研究经Mann-Whitney U检验发现， miR-10b表达并未在淋巴结转移、ER阴性或Her-2高表达的具有高侵袭可能的原发癌中升高，由于本研究所选择的均为M0的患者，故结果与上述研究并不矛盾。临床研究还发现，miR-10b在约50%的转移性乳腺癌中呈过度表达，在正常的乳腺组织中表达下调；而与正常组织相比，原发肿瘤组织中miR-10b表达水平下调更为显著［4-6］。本研究结果提示，miR-10b在乳腺癌非转移阶段时的促侵袭作用微弱，在多步骤、多因素参与的肿瘤侵袭转移过程中，其作为预测指标的价值尚需谨慎评估。Heneghan等［7］报道，ER阴性乳腺癌的循环血清miR-10b水平比ER阳性乳腺癌的明显上调。本研究并未发现石蜡组织中miR-10b表达水平与ER/PR表达、组织学分级、组织类型等肿瘤发生的指标相关，表明miR-10b表达可能与肿瘤发生的早期阶段无关，而主要作用于肿瘤进展的晚期阶段。

Ma等［4］在研究中发现，miR-10b通过调控抑癌基因HoxD10的翻译，增加其下游转移基因RHOC的表达，进而影响肿瘤的转移和侵袭能力，其能否影响患者生存尚不明确。本研究经Kaplan-Meier生存分析表明，石蜡组织中miR-10b表达水平的高低并不影响乳腺癌预后，log-rank计算显示差异无统计学意义(P>0.05)。据此说明，相对于影响预后的众多因素，miR-10b效应并不显著。

总之，miR-10b在非转移的乳腺癌中的表达并不能区分肿瘤的侵袭性高低，也不是影响预后的主要因素。基于石蜡组织中miR-10b表达作为乳腺癌预测预后指标的潜在价值有限，具体作用还需进一步研究。

［1］LI H, BIAN C, LIAO L, et al. miR-17-5p promotes human breast cancer cell migration and invasion through suppression of HBP1 ［J］. Breast Cancer Res Treat, 2011, 126(3): 565-575.

［2］TAVAZOIE S F, ALARCON C, OSKARSSON T, et al.Endogenous human microRNAs that suppress breast cancer metastasis ［J］. Nature, 2008, 451(7175): 147-152.

［3］LI J, SMYTH P, FLAVIN R, et al. Comparison of miRNA expression patterns using total RNA extracted from matched samples of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) cells and snap frozen cells ［J］. BMC Biotechnol, 2007, 7: 36.

［4］MA L,TERUYA-FELDETEIN J, WEINBERG R A. Tumour invasion and metastasis initiated by microRNA-10b in breast cancer ［J］. Nature, 2007, 449(7163): 682-688.

［5］IORIO M V, FERRACIN M, LIU C G, et al. MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer ［J］. Cancer Res, 2005, 65(16): 7065-7070.

［6］NEGRINI M, CALIN G A. Breast cancer metastasis: a microRNA story ［J］. Breast Cancer Res, 2008, 10(2): 203.

［7］HENEGHAN H M, MILLER N, LOWERY A J, et al.Circulating microRNAs as novel minimally invasive biomarkers for breast cancer ［J］. Ann Surg, 2010, 251 (3):499-505.

Correlation of miR-10b with invasiveness and prognosis of breast cancer

SONG Chuan-gui, FU Fang-meng, WU Xue-ying, HAN Zhong-hua, WANG Chuan(Department of Breast Surgery, Union Hospital Affiliated to Fujian Medical University, Fuzhou Fujian 350001, China)

SONG Chuan-gui E-mail：risingeast@163.com

Background and purpose：The miR-10b has the potential to promote invasiveness and metastasis of tumor by improving the expression ofRHOCgene. The objective of this study was to investigate the potential use of miR-10b as a novel breast cancer biomarker.Methods：Extracting RNA from the formalin-f i xation and paraff i nembedding (FFPE) breast cancer tissue, and the levels of miR-10b were quantified in specimens of 60 patients with operative breast cancer, by real-time quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) analysis. The statistical analysis includedMann Whitney-U test, Kaplan-Meier curve and log-rank calculation.Results：There was no statistically significant correlation between miR-10b level and existing clinico pathological parameters of breast cancer, such as tumor size, nodal status, histological grade, hormone receptor status, tumor subtype, stage of disease or relapse result(P＞0.05). No correlation was found between miR-10b level and breast cancer survival (P=0.485).Conclusion：It is suggested that the role of miR-10b on invasiveness and prognosis of breast cancer is weak, which limits its potential use as disease classifier and prognostic factor on FFPE tissue.

Breast neoplasm; miR-10b; Metastasis; Prognosis;Formalin-f i xation and paraff i n-embedding

10.3969/j.issn.1007-3969.2012.01.007

R737.9

A

1007-3639(2012)01-0031-04

福建省教育厅基金(No: JA11120)；福建省自然科学基金项目(No: 2006J0096)。

宋传贵 E-mail:risingeast@163.com

2011-08-08

2011-11-24）