妊娠期高血压疾病患者胎盘组织中ApoE、LPL ser447stop基因多态性检测及意义

(南昌大学第二附属医院，南昌330006)

妊娠期高血压疾病(HDP)是妊娠期特有的疾病，为孕产妇及围生儿死亡的重要死因［1］，其病因及发病机制尚未完全明了。近期研究表明，HDP患者存在一定程度脂质代谢变化，由此推断该病的发生、发展可能与血脂代谢异常有关［2］。载脂蛋白酶E(ApoE)及脂蛋白脂酶(LPL)是脂代谢的关键因子，若干环境因素是影响ApoE及LPL突变致病的重要因素，妇女妊娠则是最常见的环境因素［3］。为探讨ApoE基因及LPL基因第9外显子(ser447stop)多态性是否与 HDP有关，本研究采用HDP患者胎盘组织与正常产妇胎盘组织作为研究对象，通过对组织中 ApoE基因及 LPL基因ser447stop多态性分布情况来探讨其与HDP的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 随机选取江西省妇幼保健院、南昌大学第一附属医院及赣南医学院附属医院2007年9月～2010年9月汉族妊娠期高血压患者36例作为A组，子痫前期94例作B组。产后追踪12周，均排除原发性高血压、肾病、糖尿病。同期选择正常妊娠妇女130例作为C组。研究对象均签署知情同意书，并经医院道德伦理委员会通过。各组年龄、孕前体质量、身高、孕产次、孕周情况比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。术中取产妇的胎儿面胎盘组织约5 cm×3 cm×3 cm(避开钙化、坏死及血管区)，独立装于样本袋中，保存于－20℃冰箱内。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取与检测 采用经典的酚—氯仿方法提取，经琼脂糖凝胶电泳法检测。

1.2.2 ApoE基因多态性检测 采用等位基因特异性多重聚合酶链反应(multi-ARMS PCR)技术。①目的片段的扩增:引物设计根据Gerard等［4］报道的引物序列。上游引物P1为5'-CGCGGACATGGAGGACGTTT-3'，P2 为 5'-CGCGGACATGGAGGACGTTC-3'，P3 为 5'-ATGCCGATGACCTGCAGAATT-3'，P4 为 5'-ATGCCGATGACCTGCAGAATC-3'，以及公共下游引物P5为5'-GTTCAGTGATTGTCGCTGGGCA-3'。按照文献［5］方法，为了监控反应体系的有效性，以低密度脂蛋白受体外显子13为内参照系统，引物序列 P6为 5'-AACAACTGACCCCGCTGGCG-3'，P7 为 5'-ATGGCGCTGAGGCCGCGCTC-3'。PCR反应体系:分为 A、B两管。其中A管为50 μM/L 的 P1、P3、P6、P7 各0.4 μL，B 管为 50 μM/L的 P2、P4、P6、P7 各 0.4 μL;两管均加入 50 μM/L的 P5 0.8 μL，dNTP(0.2 mmol/L)0.5 μL，镁离子(1.5 mmol/L)1.5 μL，TaqDNA 聚合酶(2.5 U/μL)1 μL，10×Buffer 2.5 μL，DNA 模板6 μL，加去离子水补足至25μL。扩增条件:95℃预变性5 min，继而94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃复性1 min，共35次循环后72℃延伸7 min，于4℃保存。取扩增产物放入琼脂糖凝胶电泳，置于紫外透射仪下观察确定ApoE基因型。②ApoE基因型判断:ApoE的三种异构体(ApoE2、ApoE3、ApoE4)的氨基酸顺序均已测定，它们的区别在于第112位和第158位上半胱氨酸(Cys)和精氨酸(Arg)的互换(即碱基T与C的互换)。ApoE2/2在这两个位点上均为Cys残基;ApoE3/3在112位点上是Cys残基，在158位点上是Arg残基;ApoE4/4在两个位点上均为Arg残基。由此三种异构体而形成六种基因表型分别是ApoE2/2、ApoE3/3、ApoE4/4、ApoE3/2、ApoE4/3 和ApoE4/2。P1和P2分别检测ApoE 112位的 Cys和Arg，P3和P4分别检测 ApoE 158位的 Cys和 Arg。A管中P1与P5扩增出588 bp片段，P3与P5扩增出451 bp片段。B管中P2与P5扩增出588 bp片段，P4与P5扩增出451 bp片段。

1.2.3 LPL ser447stop基因多态性检测 采用聚合酶链反应—限制性内切酶片段长度多态法(PCRRFLP)。①目的片段的扩增:引物根据引物设计的一般原则设计。上游引物为 5'-TATTCACATCCATTTTCTTC-3'，下游引物为 5'-GTCAGCTTTAGCCCAGAATG-3'，扩增产物长度为155 bp。扩增体系:10 ×buffer 2.5 μL，MgCl2(25 mM)1.5 μL，dNTP(Mix，10 mM)0.5 μL，hot-tag 酶(2.5 U/μL)1 μL，引物(上下游各 50 μM)2 μL，模板 DNA(10 ng/μL)6 μL，ddH2O 9.5 μL。扩增条件:94 ℃预变性11 min，继而94℃变性45 s，57℃退火45 s，71℃复性1min，共35次循环后72℃延伸10min，于4℃保存。取扩增产物放入琼脂糖凝胶电泳，置于紫外透射仪下观察拍照。②扩增片段的限制性酶切及检测:取PCR扩增产物17μL，加限制性内切酶MnlⅠ0.2μL、buffer G 2μL及 ddH2O 5μL;37℃过夜消化后于琼脂糖凝胶上进行电泳，同时电泳槽孔中加入高脂血症患者的LPL基因突变(ser447stop杂合子)阳性标本为对照，置于紫外透射仪下观察拍照。③酶切产物结果分析:LPL的ser447stop突变是位于第9外显子的1 595核苷酸处C和G转换的结果，这样丝氨酸447密码TCA过早的转化为终止密码子TGA。MnlⅠ内切酶能把有ser447stop突变的PCR扩增产物切开，即把155 bp片段切成117 bp和38 bp。而无突变的PCR扩增产物不能被MnlⅠ内切酶切开，故保持155 bp。按酶切结果将其分为无突变型(CC)、突变杂合子型(CG)及突变纯合子型(GG)。通过将酶切结果与高脂血症患者LPL ser447stop杂合子的阳性标本进行对照来了解其是否存在突变。

1.3 统计学方法 计数资料用频数表示。ApoE等位基因频数计算根据以下公式:ε2=2×E2/2+E2/3+E2/4，ε3=2 × E3/3+E2/3+E3/4，ε4=2 × E4/4+E3/4+E2/4;LPL等位基因频数计算根据以下公式:C=2×CC+CG，G=2×GG+CG;计数资料组间比较采用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ApoE基因型检测结果 共检测到5种ApoE基因表型，分别是 ApoE2/3、E2/4、E3/3、E3/4 及E4/4(见图 1、2)。A 组 ApoE2/3、E2/4、E3/3、E3/4及E4/4基因表型频率分别为25.00%(9/36)、0、50.00%(18/36)、22.22%(8/36)、0，B 组分别为19.15%(18/94)、0、56.38%(53/94)、24.47%(23/94)、1.06%(1/94)，C 组分别为 14.61%(18/130)、3.08%(4/130)、76.92%(100/130)、5.38%(7/130)、0.77%(1/130)。A、B 组E3/3、E3/4 基因表型与C组比较，P均＜0.01。A组ApoE等位基因ε2、ε3、ε4 频率分别为 12.50%(9/70)、73.61%(53/70)、11.11%(8/70)，B 组分别为 9.57%(18/190)、78.19(%(147/190)、13.30%(25/190)，C 组分别为 8.46%(22/260)、86.54%(225/260)、5.00%(13/260)。A、B 组 ApoE 等位基因 ε3、ε4 与C 组比较，P 均 ＜0.05。

2.2 LPL ser447stop基因型检测结果 所有胎盘组织中发生LPL ser447stop突变的只有3例，其中B组2例，C组1例，均为突变杂合子型(CG)。各组间比较，P均＞0.05。详见图3。

3 讨论

图1 ApoE3/3、E4/4、E4/2 基因型

图2 ApoE3/2、E4/3基因型

图3 LPL第9外显子PCR产物酶切结果

3.1 脂代谢与正常妊娠的关系 妊娠期体内血脂代谢非常活跃，这对胎儿的生长发育是有利的［5］。由于妊娠期血脂与高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)同时升高，HDL有助于乳糜微粒(CM)和极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)的合成，阻止自由胆固醇积累在动脉壁，而且机体内皮依赖性血管舒张反应也增强，故妊娠期高脂血症不能引起心血管疾病的发生［6］。

3.2 脂代谢与HDP HDP患者在高脂血症基础上进一步发生改变，TG和游离脂肪酸水平异常升高及耗氧量增加，使脂质过氧化物(LOP)增多并产生自由基损伤血管内皮细胞，使血管壁内皮细胞通透性增加，刺激单核细胞进入血管壁，最后易使LDL-C在血管壁和组织中沉积，形成粥样斑块，使小动脉腔狭小，外周阻力增加，血压升高，导致血管痉挛收缩等一系列病理生理变化。同时，氧化的LDL抑制前列腺素合成酶，使前列环素(PGI2)减少，激活血栓素合成酶，使血栓素A2生成及血小板凝集，加重血压升高、血小板凝集而发生弥散性血管内凝血(DIC)、肾及胎盘血管收缩、脑血管收缩造成子痫等。HDP是多因素共同作用的结果，脂代谢异常可能是其中的一个重要环节［7］。

3.3 ApoE的生物学特性以及其多态性与HDP的关系 ApoE是脂蛋白与受体结合的配体，通过ApoE，胆固醇可在体内重新分布。ApoE的多态性影响血脂的代谢和利用［8］。它有3个主要等位基因(即 ε2、ε3、ε4)，编码的 3 种异构体(即 ApoE2、E3、E4)，形成6 种表型(即 ApoE2/2、E2/3、E2/4、E3/3、E3/4、E4/4)。3种异构体与脂蛋白受体亲和力不同，ApoE2与受体亲和力低下，而ApoE4却很高;ApoE4表型具有升胆固醇的作用，而ApoE2表型则相反［9］。Belo等［10］发现，ApoE 基因多态现象并不是先兆子痫发病的危险因子，仅与妊娠晚期孕妇脂质水平有关。国外也有文献报道，ApoE等位基因ε2和ε4频率在非洲及欧洲地区先兆子痫患者中过度表达，但同时也有相反的报道［11］。

本研究共检测到 ApoE2/3、E2/4、E3/3、E3/4 和E4/4共5种基因表型。其中ApoE3/4基因表型在A、B组的频率分别是22.22%和24.47%，两组均较C组(5.38%)高(P 均 ＜0.01)。在 A、B 组中，ε3 等位基因型的频率分别是73.61%和78.19%，两组均较C组(86.54%)低(P 均 ＜0.05);而 ε4 等位基因型的频率分别是11.11%和13.3%，两组均较C组(5%)高(P均＜0.05)。分析原因可能与ApoE的不同异构体与受体的亲和力不同有关。由于亲和力不同而导致ApoE浓度的差异，从而影响脂蛋白与受体的结合，使胆固醇在体内的重新分布异常，减缓了外周组织将LDL-C逆转运到肝脏的能力，使LDL-C在血管壁和组织中沉积，进一步导致妊娠期高血压的发生。通过本研究可推断出ApoE3/4基因表型可能是HDP的危险因素;ε4等位基因可能是HDP的遗传易患因子，而ε3等位基因可能具有保护作用。

3.4 LPL基因的生物学特性及其ser447stop突变与HDP的关系 LPL水解血液中的甘油三酯，生成的甘油和脂肪酸可供组织氧化分解并提供能量。LPL的缺陷或活性降低均可导致血浆TG及VLDL的升高。近年的研究发现，LPL基因突变可能与糖尿病、肥胖、冠心病、高血压、阿尔茨海默病、围产期疾病等相关［12］。LPL的基因多态性对HDP是否有关联也众说纷芸，其中LPL ser447stop基因突变对血压影响的文献较多见。Salah等［13］研究发现，LPL ser447stop基因变异的携带者发展为高血压的风险很高。Chen等［14］对台北地区HDP的患者及其父母的研究发现，LPL ser447stop基因突变可能是一种保护因子。孙瑜等［15］研究LPL的ser447stop变异与HDP的影响发现，其对HDP无影响。

本研究共检测到3例突变，其中B组2例，C组1例，均为杂合子。根据基因多态性的定义，可以认为我们所研究的这一人群可能无LPL ser447stop多态性。故认为LPL ser447stop基因多态性可能与HDP的发生无关。结合国内外文献，分析原因推测可能因为人种差异，因此LPL ser447stop基因多态性对HDP关联的结果，与国外的报道不同。

综上所述，HDP与多重因素有关，而脂代谢异常只是其中一种因素。我们的研究发现，ApoE的不同表型对HDP的发病率不同，而LPL ser447stop基因多态性与HDP可能无关联，但因样本量的局限，仍需进行多角度、多层面的试验方可证实。

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