非生殖器部位脂溢性角化病组织中HPV L1蛋白及HPV16、18 DNA的检测及意义

(三峡大学医学院，湖北宜昌443002)

脂溢性角化病(SK)又名老年疣、脂溢性疣及基底细胞乳头瘤，是表皮和真皮结缔组织共同增生构成的良性肿瘤。由于SK临床和组织病理表现与HPV感染引起的病毒疣有众多相似之处，国内外学者开始研究SK与HPV之间的关系，但并没有达成共识［1～6］。本研究的目的是通过检测SK组织中高危型HPV16和18的存在情况，以确定这两型HPV是否与SK发病有关。

1 材料与方法

1.1 材料 收集宜昌市第一人民医院病理科2009～2011年的SK石蜡标本43例份(观察组)，组织来源均为非生殖器部位，其中取自四肢17例、头面部23例、躯干3例;患者年龄为38～78岁，＞50岁者35例。正常皮肤组织标本(对照组)15例份来源于整形美容科，其中取自躯干7例、面部5例、四肢3例;年龄为 20 ～ 45 岁。查阅文献［7，8］设计引物，由上海生工合成。PCR Master Mix，DNA marker;小鼠抗HPV L1单克隆抗体，检测型别为 HPV1、6、11、16、18、31;DyLight549 标记山羊抗小鼠 IgG，DAPI染色液，其他相关试剂均为进口或者分析纯。仪器包括HM340E石蜡切片机、ECLIPSE TE2000-S倒置荧光显微镜、DMR型图像分析系统、MJMini梯度PCR仪、DYCP-31DN型电泳仪、Gel Logic 100凝胶成像系统。

1.2 方法

1.2.1 HPV L1蛋白检测方法 将石蜡组织连续切片，每片4μm;采用免疫组化法检测HPVL1蛋白，按试剂盒说明书进行。设置尖锐湿疣病理标本为阳性对照，荧光显微镜下555 nm激发，出现红色荧光为阳性;将一抗改为PBS的空白对照，无可见红色荧光;正常皮肤组织为阴性对照。

1.2.2 HPV16、18 DNA检测方法 采用 PCR法。采用简单裂解法从组织中提取总 DNA［9～11］。－20℃保存备用。PCR步骤参照文献［7，8］进行。取5μL的PCR反应产物与1μL的溴酚蓝上样缓冲液混匀，2%琼脂糖凝胶电泳。在KODAK凝胶成像仪上扫描，照相。提取到的总DNA首先进行β-globin扩增，以保证提取方法及反应条件的正确性和可靠性，并设置阳性对照(CaSik细胞、HeLa细胞)和阴性对照(HaCat细胞);琼脂糖凝胶电泳出现目的条带:βglobin目的条带为126 bp，HPV16 E6目的条带为397 bp，HPV18 E6目的条带为322 bp。

1.2.3 统计学方法 采用SPSS13.0统计软件。组间比较用确切概率法。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HPV L1蛋白检测结果 观察组阳性部位主要在上皮角化层及深部的角化珠内，角化层阳性反应一般呈中等强度的荧光反应，细胞核存在的部位多数无红色荧光出现，呈负染状态。观察组出现阳性反应20例，阳性率为46.51%;对照组阳性4例，阳性率为26.67%。两组比较，P ＞0.05。

2.2 HPV16、18 DNA检测结果 观察组和对照组HPV16 E6和HPV18 E6均无阳性结果，见图1～3。

3 讨论

HPV属乳多空科病毒衣壳包含L1、L2两种结构蛋白。根据完全L1序列的开放读码框，可以将HPV分类编制成进化分支图［12］。其分类可以分为属、种、型三级，共有 α、β、γ、δ等 18个属。根据HPV感染人类组织的不同，又可将其分为两型。皮肤相关型 HPV 主要有 HPV1、2、3、4、7、10、26 ～29、41、49、57、60、63、65、75 ～77 等;黏膜相关型 HPV 根据致癌性的大小又可分为高危型(HPV16、18)、中危型(HPV31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82、83)、低危型(HPV6、11、26、30、32、40、42 ～44、53 ～55、62、6、70、72、81)。

图1 临床标本中β-globin基因引物扩增电泳结果

图2 脂溢性角化病标本中HPV16 E6引物扩增凝胶电泳结果

图3 脂溢性角化病标本HPV18 E6引物扩增凝胶电泳结果

本实验经过对HPV 16E6、HPV 18E6引物行PCR扩增，观察组及对照组标本中均无阳性结果。我们认为，HPV16、HPV18不是非生殖器部位SK的致病因素。Akiyo等［6］应用原位杂交、PCR、DNA 杂交等方法检测104例SK病变组织中的HPV DNA，同时对原位杂交阳性的标本进行免疫组化法检测病毒衣壳蛋白，检测型别包括黏膜型HPV(HPV6、11、16、18、30、31、33、35、45、51、52、56、58)和皮肤型HPV(HPV1、2)。结果显示，28.8%的 SK 标本中存在HPV DNA，原位杂交的阳性反应在表皮角质形成细胞的胞核内;免疫组化结果显示，在颗粒层和角质层的角蛋白细胞核内有HPV蛋白的表达;PCR结果显示，HPV18感染率为 83.7%，HPV6感染率为77.9%，HPV18和 HPV6混合感染者占到70.2%，而 HPV1(7.7%)和 HPV2(14.4%)的感染率相对较低。作者推测，HPV很可能在SK的发病机制中起到重要的作用，其作用是通过混合感染HPV18和HPV6或者某些其他型别而实现的。Bai等［6］的研究结果显示，外阴部位SK中HPV DNA的阳性率达72%，主要为低危组的HPV6、11;HPV DNA呈阳性的标本中，Ki-67相应的单克隆抗体Mib-1全部阳性，与其他女阴部病损相比差异有统计学意义。Mib-1作为目前较为肯定的核增殖标志，其阳性大致可反映皮损中HPV的存在。本实验结果与上述研究存在差异的原因可能是取材部位不同，我们主要选择非生殖器部位的SK标本，而Akiyo［4］及Bai等［6］的标本来源于生殖器部位。非生殖器部位与HPV的感染有无相关性也存在争论，Tsambaos等［2］应用原位杂交的方法检测173例非生殖器部位SK中的HPV，HPV阳性率达到19.65%，在34例阳性标本中15 例 HPV6、11 阳性，14 例 HPV31、33、35 阳性，另有5例阳性显示是其他型别感染;因此作者认为，非生殖器部位的SK中相当一部分病例与HPV的感染有相关。而Lee等［3］应用原位PCR探针杂交和PCR法检测40例非生殖器部位SK中的HPV6、11、31、33，结果所有标本均是阴性，认为HPV6、11、31、33不是非生殖器部位 SK的致病因素。Li等［5］应用通用型引物对55例非生殖器部位SK的活检组织进行巢氏PCR和测序分型，观察组疣状表皮发育不良相关性 HPV(HPV 5、8、9、12、14、15、17、19 ～25、36 ～38、47、49)的阳性率为 76%，与对照组比较有显著性差异;作者认为，疣状表皮发育不良型HPV在非生殖器部位SK的发病机制中起到一定的作用。本实验结论及Lee等［3］的研究结果共同证明黏膜型HPV与非生殖器部位的SK没有相关性。

本研究结果显示，SK标本中HPV L1蛋白的检出率较高，但与对照组相比差异无统计学意义，说明SK标本中存在HPV的感染，但不是致病因素。蛋白检测的结果与HPV DNA的检出情况存在差异，其原因可能是我们PCR中所用的HPV引物是针对黏膜型HPV16、18的，而鼠抗可以检测5个黏膜型HPV L1蛋白(HPV6、11、16、18、31)和 1 个皮肤型HPV L1蛋白(HPV1)，由此可以推测免疫荧光法实验中检测到的HPV L1可能为HPV16、18以外的其他型别HPV，因此说明有必要设计针对皮肤型的HPV引物进行PCR。

研究［13～15］证实，上皮的存在对于 HPV 感染上皮基底层角质形成细胞是必须的，但是病毒DNA的扩增只发生在中上层棘细胞向最终的扁平鳞状细胞分化的过程中。大部分微小的病毒蛋白，如L1、L2蛋白表达在上皮的表层，在这个部位子代病毒颗粒被组装，最终随着角化的团块脱落。本实验SK标本的阳性反应主要表达在上皮角化部及深部的角化珠内，与上述研究结果相一致。

通过本实验我们认为非生殖器部位SK中并不存在HPV16、18 DNA，其发病机制与高危型HPV不相关，但是非生殖器部位SK中有HPV1、6、11、31中某一型或者某几型L1蛋白的存在，属于非特异性感染。下一步可收集更多的石蜡标本应用原位杂交的方法检测更多的HPV型别与SK的相关性。

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