糖尿病ED大鼠阴茎海绵体中血红素加氧酶的表达变化及意义

(辽宁医学院附属第一医院，辽宁锦州121001)

勃起功能障碍(ED)是男性糖尿病(DM)患者常见的并发症之一，也是男性DM患者生活质量降低的重要因素。据估计男性DM患者的发病率为35% ～75%，是非DM患者的3倍。目前研究认为，糖尿病性ED(DM-ED)的形成是多因素造成的，其中NO-GC-cGMP信号通路受损和氧化应激失衡在DM-ED的病理机制中具有重要作用。近年来，血红素加氧酶(HO)在勃起功能中的作用备受关注［1］。一氧化碳(CO)是HO催化降解血红素的产物之一，与一氧化氮(NO)有类似的生物学活性，具有浓度依赖性舒张阴茎海绵体平滑肌的作用［2］;并且，HO表达与机体的氧化应激水平有密切关系［3］，但关于HO与DM-ED的相关研究少见。2010年9月～2011年10月，我们建立DM-ED大鼠模型，观察该模型大鼠阴茎海绵组织中HO的表达变化，探讨其与DM-ED的关系。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器 链脲佐菌素(STZ)、阿扑吗啡(APO)，均为 Sigma公司产品;兔抗大鼠 HO-1、HO-2多克隆抗体和免疫组化染色试剂盒，购自北京博奥森生物技术有限公司;三诺安稳型血糖仪及配套试纸;GENE GENIUS凝胶图像分析系统。

1.2 动物模型制备及分组 雄性SD大鼠40只(购自辽宁医学院实验动物中心)，体质量260～300 g，为同一批繁殖并与发情雌鼠交配试验证实具有正常的性功能。随机取30只经腹腔注射STZ(65 mg/kg)制作DM模型，余10只作为正常对照组(NC组)。72 h后采用断尾取血法测定血糖，血糖 ＞16.7 mmol/L为造模成功。每周测定大鼠血糖1次，血糖＜16.7 mmol/L者剔除。大鼠自由饮食水，昼夜交替饲养。造模8周后，采用APO诱导试验(大鼠颈部皮下注射 APO 80μg/kg)［4］评价 DM 大鼠的勃起功能，15只发生ED者为DM-ED组，12只(3只死亡)未发生ED者为单纯DM组。

1.3 HO-1、HO-2的检测方法 两组大鼠麻醉后取阴茎海绵体组织，4%甲醛固定，常规石蜡包埋并切片，予以免疫组化SP法染色，观察HO-1、HO-2表达部位，阳性细胞表达呈棕黄色。按试剂说明书操作，用胰酶抗原修复，室温修复20 min，封片后光镜下观察并摄片。采用Western blot法检测HO-1和HO-2表达水平:取冻存大鼠阴茎海绵体组织进行蛋白样品制备，采用BCA法测定蛋白浓度，以β-actin为内参，12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，偏二氟乙烯膜转移。常规显影、定影，用GENE GENIUS凝胶成像系统分析其灰度值，以相应内参灰度值进行标准化。以目的蛋白与内参灰度值比值×100作为蛋白相对表达量。

1.4 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件。数据以±s表示，两组比较采用t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

各组中均有HO-1、HO-2表达，主要表达于海绵体平滑肌细胞和血管内皮细胞胞质中。各组阴茎海绵体组织中HO-1、HO-2相对表达量比较，见表1。

3 讨论

表1 各组阴茎海绵体组织中HO-1、HO-2相对表达量比较(±s)

表1 各组阴茎海绵体组织中HO-1、HO-2相对表达量比较(±s)

注:与NC 组比较，*P ＜0.01;与单纯 DM组比较，#P ＜0.05，△P＜0.01

HO-1 HO-2 NC组组别11.38 ±1.77 27.69 ±5.07单纯 DM 组 28.49 ±4.74* 16.41 ±2.75*DM-ED 组 18.02 ±3.19*# 7.04 ±2.94＊△

HO在体内有丰富的生物学作用，且与氧化应激关系密切，多见于DM相关并发症的研究中［5］，其与DM-ED关系的研究少见。Hedlund等［6］研究发现，阴茎海绵体中含有HO-1神经纤维，阴茎血管内皮中存在HO-1和HO-2的表达，认为HO/CO系统与NOS/NO系统在阴茎勃起机制中一定的互补作用。

氧化应激被认为是DM-ED的发病机制之一［7］。高血糖状态使阴茎海绵体局部晚期糖基化终末产物增加，诱导细胞内氧化应激反应，活性氧(ROS)生成增多;ROS随着DM病程的延长而增加，抗氧化物的表达及活性下降，且与DM-ED的严重程度相关［8］。氧化应激损伤DM大鼠血管内皮和海绵体结构;大量的ROS与NO反应，生成高毒性的过氧亚硝酸盐(ONOO－)，降低NO的生物利用度，对组织的结构和功能造成进一步损害，且反馈生成更多的ROS，恶性循环最终诱导ED的发生。ROS还可通过其他途径参与ED的病理机制，ROS使eNOS磷酸化受阻，降低eNOS的活性;活化Rho/Rho激酶通路，增强海绵体平滑肌收缩敏感性等［9］。有研究结果证明，抗氧化物还原性谷胱甘肽［10］和过氧化物歧化酶类似物［11］可改善DM大鼠的勃起功能，也间接验证了氧化应激在DM-ED发病机制中的重要性。

高血糖诱导氧化应激损害可适应性上调HO-1的表达，减弱氧化应激造成的损伤;HO-1的表达增加常与应激刺激有关，且对机体常起到保护作用［12］。实验［13］证明，上调 HO-1 表达能诱导抗氧化基因的表达，比如细胞外超氧化物歧化酶(ECSOD)和胞质内过氧化氢酶等，提高细胞抗氧化活性，降低氧自由基的生成;提高血管对乙酰胆碱的舒张反应，改善DM导致的血管内皮功能损害。有学者［14］发现，HO-1的表达能抑制烟酰胺腺嘌呤二核苷酸基磷酸盐(NADPH)氧化酶的活性，减少过氧化物的形成，减轻氧化应激损伤。有研究［15］证实，姜黄素通过提高阴茎海绵体内HO-1的活性、增加cGMP的含量和阴茎海绵体内压，调节大鼠的勃起功能。

HO-2与HO-1具有共同的生物学作用，为结构型酶，其表达基本不被诱导。内源性的CO主要由HO-2催化生成。NO/GC/cGMP信号通路在勃起功能中的作用已被公认。CO是与NO类似的气体分子，在体内有和NO相似的生物学活性，CO可通过活化鸟苷酸环化酶(GC)刺激cGMP的生成，起到舒张阴茎海绵体平滑肌的作用，在勃起功能中有重要作用［8，9］。HO-2基因缺陷的动物，DM 相关氧化应激水平增加，对局部组织或器官结构和功能造成损害［16］。HO-2的表达下降，使胆绿(红)素等有抗氧化活性的内源性物质生成减少，氧化应激水平失衡;且CO生成减少，阴茎海绵体平滑肌结构受损及舒张功能受限，不利于阴茎的正常勃起。有研究［17］认为，慢性肾衰大鼠勃起功能受损可能与阴茎海绵体中HO-2的表达降低有关。

本研究发现，HO-1、HO-2主要表达于大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞和血管内皮细胞胞质中。与正常对照大鼠，单纯DM大鼠和DM-ED大鼠阴茎海绵体组织中HO-1表达均增加，HO-2的表达均降低;而与单纯DM大鼠相比，DM-ED大鼠HO-1、HO-2的表达均降低。我们认为，DM大鼠在高血糖的应激状态下氧化应激水平增加，适应性诱导HO-1的表达增加，氧化应激对平滑肌和血管内皮的损伤使HO-2的表达降低;上调的HO-1可增强局部的抗氧化能力，对机体有保护作用，单纯DM大鼠HO-1代偿能力较强，且HO-2的表达下降不明显，能对抗氧化应激造成的损害，维持正常的勃起功能;与单纯DM大鼠相比，DM-ED大鼠HO-1的代偿增加不足，HO-2表达又进一步降低，局部抗氧化能力显著下降;且HO表达降低导致CO生成减少，进而cGMP的生成量也减少，阴茎海绵体平滑肌的结构受损和舒张功能受限，不利于勃起机制的发生，最终形成ED。

综上所述，DM-ED大鼠阴茎海绵体组织中HO-1表达代偿不足、HO-2表达明显下调;HO-1、HO-2可能参与DM-ED的发生发展，其具体机制仍待进一步研究。

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