乙型肝炎病毒x基因转染肾小管上皮细胞导致细胞凋亡的机制探讨

王 轩 周 益 朱 楠 袁伟杰

乙型肝炎病毒(HBV)感染除了导致急/慢性肝炎、肝硬化、肝癌以外，还可以并发多种肝外损害，其中HBV相关性肾炎(HBV－GN)最为常见，其发病机制至今尚未完全阐明。于艳等［1］研究发现，HBV－GN患者肾小管上皮细胞中存在HBV x基因(HBx)mRNA的异常表达，提示HBx与肾小管上皮细胞的损伤凋亡密切相关。Toll样受体4(TLR4)作为识别病原微生物的主要受体，可识别HBV，并抑制其复制;TLR4亦是一个损伤敏感性高度表达蛋白质，在急性肾损伤中表达上调并诱导细胞凋亡［2］。据此，本研究以人近端肾小管上皮细胞系(HK－2细胞)为研究对象，将HBx瞬时转染入细胞中，旨在观察HBx对HK－2细胞TLR4表达及细胞凋亡、细胞因子分泌的影响。

材料与方法

主要材料 HK－2永生化细胞株由上海长征医院梅长林教授馈赠。K－SFM无血清培养基购自GIBCO公司，限制性内切酶Kpn I和EcoR V、Taq酶购自Takara公司;T4 DNA连接酶、感受态细菌TOP 10、DNA纯化回收试剂盒和质粒抽提试剂盒购自TIANGEN公司;脂质体转染试剂 LipofectamineTM2000、Trizol RNA提取试剂盒购自Invitrogen公司，HBx抗体和TLR4抗体购自Abcam公司，ECL化学发光试剂盒购自Sigma公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒购自碧云天生物科技，AnnexinV、PI购自BD公司，白细胞介素4(IL－4)ELISA kit、干扰素 γ(IFN－γ)elisa kit购自sunteam公司。

实验方法

质粒构建 根据GenBank中ayr亚型HBV基因组序列，设计HBx基因的引物，其引物上、下游分别包含有Kpn I和EcoR V内切酶酶切位点(画线处为酶切位点)，上游引物为5’－GGGGTACCGTGGCAGAGGTGAAAAAGTTGC－3’，下游引物为5’－GCCGATATCCTAACATTGAGATTCCCGAG－3’扩增纯化HBx基因片段，将纯化得到的 HBx片段与pcDNA3.1/myc质粒分别用限制性内切酶Kpn I和EcoR V进行双酶切，于琼脂糖凝胶上电泳、回收纯化酶切产物，经T4 DNA连接酶16℃过夜连接后，转化TOP 10感受态细胞，氨苄青霉素筛选培养，挑取阳性克隆扩增后提取质粒进行双酶切和DNA测序鉴定。

细胞培养 从液氮中取出冻存的HK－2细胞，迅速复苏后置于K－SFM无血清培养基中，培养条件为37℃，5%CO2，隔天换液，细胞贴壁生长，密度达80%时，0.25%胰酶消化传代。

质粒转染 取对数生长期细胞，以8×105/孔接种至六孔板，K－SFM无血清培养基中37℃，5%CO2贴壁培养过夜。真核表达质粒用LipofectamineTM2000转染试剂进行转染，转染过程参照LipofectamineTM2000说明进行。步骤简述如下:(1)将一定量的HBx质粒或空载质粒溶于一定量的Opti－MEM I中，轻柔混匀(使用的量根据说明书计算获得);(2)稀释一定量的Lipofectamine 2000至一定量的Opti－MEM I中，室温孵育5 min;(3)将二者混匀，室温孵育20 min;(4)每孔加入混合物和一定量的Opti－MEM I，轻柔混匀，37℃孵育6h后换液继续培养。转染24h后在显微镜下观察细胞的形态。实验分为三组:未处理细胞组、转染pcDNA3.1b/myc质粒组和转染pcDNA3.1b/myc－HBx 质粒组。

RT－PCR验证HBx转染、检测TLR4 mRNA水平

用Trizol提取RNA，RNA用于反转录合成cDNA。cDNA模板于包含有ddH2O、10×反应缓冲液、dNTP、SYBR Premix EX Taq、DNA聚合酶和引物的PCR混合液中扩增。HBx及TLR4特异性引物序列见表l。热循环体系:95℃变性30s，接着40个循环包括95℃变性20s，60℃退火30s，72℃延伸20s。溶解曲线分析:温度从60℃以0.2℃/s的速度升至95℃，用于评估扩增的特异性。各样本HBx基因的扩增结果用 GAPDH的浓度校正。2－△△CT法计算HBx mRNA、TLR4 mRNA的倍数变化。

表1 各基因引物序列

Western Blot验证质粒特异性、检测TLR4水平

蛋白样品收集 将培养的细胞吸去培养液，用PBS冲洗两次后，加入2×细胞裂解液用枪头搅动以充分裂解细胞，95℃水浴加热10 min，立刻置于冰上，可立即使用或储存于－70℃。用BCA试剂盒(PIERCE)进行蛋白质定量，取合适量的裂解液加入等体积2×蛋白上样缓冲液，95℃水浴变性10 min，即可用于 Western Blot分析，或储存于 －70℃冰箱。

蛋白印迹 (1)电泳:SDS－PAGE电泳，80V 30 min，160V 50 min左右。(2)转膜:电泳结束后，将凝胶移入转膜缓冲液固定3～5 min。硝酸纤维素膜先用ddH2O浸湿后再用转膜缓冲液浸泡。按转膜电极板阴极至阳极方向，依次叠放滤纸、电泳凝胶、膜及滤纸。去除各层间的残留气泡，湿转仪(Invitrogen)30V转膜35 min。(3)转膜完毕后将膜置入含5%(w/v)脱脂奶粉的PBST中，室温下封闭1 h。(4)用封闭液稀释一抗，室温下反应2 h，或4℃反应过夜，用PBST洗涤3次，5 min/次。(5)用封闭液稀释荧光二抗，室温下反应30 min，用PBST洗涤3次，5 min/次。(6)用Odyssey红外成像系统(LI－COR Biosciences)扫描硝酸纤维素膜。

流式细胞术检测细胞凋亡 转染24h后的HK－2细胞以及未转染的对照组细胞用0.25%胰酶消化后收集细胞，每管细胞数1×105/100 μl，经 PBS洗涤2次，用凋亡检测Buffer洗涤一次，分别加入5 μl AnnexinV 和10 μl PI，室温孵育15 min后，再加入凋亡检测Buffer 400 μl，上FACS流式细胞仪检测后，用CELLQuest软件进行数据分析。

ELISA检测细胞培养上清中IL－4、IFN－γ水平取对数生长期的三组细胞，以2.5×106/孔接种至六孔板内，培养24h后，收集细胞培养上清，－80℃保存。按照ELISA试剂盒要求操作，酶标仪450 nm处各孔A值，根据标准曲线及A值计算各待测样本的浓度值。

统计学分析 应用SPSS 17.0统计软件进行处理，结果均用均数±标准差表示，两组间均值比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

质粒图及质粒验证 所构建的质粒图如图1所示，菌液PCR鉴定，采用T7/BGH测序引物鉴定，序列正确，产物长度应为700 bp。结果表明挑选的4个克隆都为阳性(图1)。

图1 质粒图及质粒验证图

瞬时转染pcDNA3.1/myc－HBx质粒后 HK－2细胞中HBx的表达鉴定选取转染24h后的细胞为研究对 象，RT－PCR 结 果 显 示 (图 2A)，转 染pcDNA3.1/myc－HBx质粒后 HK－2 细胞可见 HBx 表达，而转染空载体pcDNA3.1/myc的HK－2细胞中未见 HBx表达。Western blot检测结果显示(图2B)，转染 pcDNA3.1/myc－HBx 质粒的 HK－2 细胞中可见HBx表达，而未经转染HBx基因的HK－2细胞未见HBx表达。

显微镜观察 pcDNA3.1/myc－HBx质粒转染后HK－2细胞的形态 显微镜下观察，正常未处理的细胞贴壁良好，呈“铺路石”样，细胞数量较多，折光性好;转染了pcDNA3.1/myc质粒后，细胞数量有所减少，细胞贴壁、折光性下降;转染 pcDNA3.1/myc－HBx质粒后，细胞数量明显下降，细胞形态不规则，贴壁率、折光性下降，细胞中有较多的颗粒，细胞状态受损(图3)。

各组HK－2细胞中TLR4的表达 RT－PCR结果(图4A)显示转染pcDNA3.1/myc细胞组和未处理细胞组中TLR4均呈低表达，转染HBx基因组较前两组细胞中TLR4 mRNA表达明显增加(P＜0.05)，前两组TLR4的水平无明显差异。Western Blot结果(图4B)和RT－PCR结果一致，转染 HBx基因组中TLR4蛋白表达水平较两组对照组明显上调(P ＜0.05)。

各组细胞凋亡情况 用Annexin V和PI双染的方法，流式细胞仪测定细胞的凋亡情况。结果显示转染pcDNA3.1/myc－HBx质粒的HK－2细胞凋亡率为14.94% ±0.32%，较对照组转染pcDNA3.1/myc质粒的 HK－2细胞 13.67% ±0.54%明显增加(P＜0.05)，较未处理的细胞13.86% ±0.18%增加(P＜0.05)。转染pcDNA3.1/myc质粒组和未处理组细胞凋亡率无统计学差异(P＞0.05)(图5)。

各组细胞培养上清中 IL－4、IFN－γ水平 ELISA结果显示(图6)转染 pcDNA3.1/myc－HBx质粒组IL－4水平(24.97±12.04)，明显低于未处理细胞组(63.80±8.50)和转染 pcDNA3.1/myc质粒组(60.11±7.58)(P＜0.05)。转染 pcDNA3.1/myc－HBx质粒组IFN－γ水平(16.32 ±2.52)明显高于未处理细胞组(12.08±0.75)和转染 pcDNA3.1/myc质粒组(12.73±2.96)(P＜0.05)。

图5 流式细胞术检测各组细胞凋亡率

图6 ELISA检测各组细胞培养上清中IL-4、IFN-γ水平

讨 论

我国是HBV感染高发地区，HBV－GN已成为我国主要的继发性肾脏疾病之一，但由于HBV结构、感染方式、免疫特性等因素的复杂性，至今HBV－GN发病机制仍不完全清楚。HBV具有明显的种属特异性，仅感染人类和某些灵长类细胞，且HBV体外感染细胞持续时间短，稳定性差，给建立HBV感染细胞模型及进一步进行相关研究带来很大的困难。由于HBx基因在HBV感染相关疾病发病过程中起关键作用［3］，因此探讨HBx基因片段功能可为更好地揭示HBV感染的发病机制提供新的实验途径。本研究以中国人易感染型HBV adr亚型中基因片段HBx作为基因来源，选择真核表达载体pcDNA3.1/myc作为母载体，构建了质粒 pcDNA3.1/myc－HBx，并经酶切、测序等鉴定，表明pcDNA3.1/myc－HBx质粒构建成功。由于所使用的人近端肾小管上皮细胞系HK－2较易进行转染，故本研究采用脂质体介导的瞬时转染法将pcDNA3.1/myc－HBx 转染入HK－2细胞，通过RT－PCR及Western Blot方法验证了HBx基因在HK－2细胞中的表达，表明已成功的建立HBx转染肾小管上皮细胞模型，这为后续细胞损伤及凋亡研究奠定了基础。

HBx基因转入HK－2细胞后，细胞形态发生不规则改变，贴壁率及折光率下降，且细胞中出现较多的颗粒。我们前期研究结果亦显示，HBV感染后肾小管上皮细胞，形态不规则，出现较多的细胞碎片，且细胞融合现象显著。提示HBV成分感染细胞后可导致细胞形态及生物学特性受损［4］。现已明确，HBx基因转入细胞后，HBx蛋白能够诱导线粒体渗透性改变，使钙离子内流至细胞质，激活钙离子依赖的激酶途径，促进HBV－DNA的复制，损伤组织细胞［5］。HBx 也可通过活化蛋白 1(AP－1)、AP－2、转录活化因子/环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(ATF/CREB)、核因子 κB(NF－κB)、活化的 T 细胞核因子(NF－AT)等多重顺式元件及肾素血管紧张素系统/促分裂原活化蛋白激酶(RAS/MAPK)、富含脯氨酸的酪氨酸激酶2(Pyk2)、C－Jun氨基末端激酶(JNK)等多个信号转导途径激活转录，促进病毒复制［6］。然而，HBx基因的转入虽使肾小管上皮细胞形态受损，但其具体机制尚不明确。

HBx是HBV复制所必需的转录因子，具有反式激活作用，不仅能通过调控多种转录因子，促进病毒的复制，损伤细胞［7］，亦能通过蛋白与蛋白之间的相互作用参与细胞的增生和凋亡［8］。HBx引起的细胞过度凋亡是HBV持续感染肝组织致肝脏纤维化及肝癌发生的重要机制之一［9］。本研究在HBx转染肾小管上皮细胞基础上，采用流式分析术检测细胞凋亡情况，发现转染HBx基因后，与对照组相比，细胞的凋亡率明显上升。我们曾在HBV－GN患者肾组织中发现Bcl－2和Bax表达显著升高，提示HBV－GN中存在细胞凋亡［10］。当细胞大量凋亡超过吞噬细胞的清除能力时，可导致大量凋亡小体的聚集、降解和前炎症内容物的释放，引起前炎症因子肿瘤坏死因子 α(TNF－α)、转化生长因子 β(TGF－β)等产生。有研究证实，HBx诱导肾小管上皮细胞的过度凋亡可导致肾小管间质纤维化［11］。

我们体内研究发现HBV－GN患者肾组织中有TLR4表达异常，且主要分布于肾小管上皮细胞及间质组织，参与肾组织病变的进展［12］。体外实验证实HBV感染肾小管上皮细胞后TLR4表达明显增加［4］。本研究采用 RT－PCR及 Western blotting检测各组细胞TLR4的表达水平，结果显示，转染HBx基因后TLR4的表达水平与对照组相比明显上升，提示HBx蛋白具备调节TLR4生成的作用。本研究还发现TLR4表达水平较高的组，细胞的凋亡率亦较高，细胞的凋亡率与TLR4水平有相关性。由此推测HBx促进细胞凋亡发生可能与其引起TLR4的表达上调有关。TLR4是一种模式识别受体，可表达于肾小管上皮细胞表面，其能识别多种病毒，启动细胞内信号转导通路，激活IL－6、TNF－α等相关炎症因子的表达，诱发细胞内的炎症反应，导致细胞损伤或细胞凋亡;TLR4也能通过MyD88途径激活NF－κB，引起后续生物学反应。据郝诚诚［13］等报道，大鼠过度训练动物模型中肾小管上皮细胞TLR4表达上调，上调的TLR4激活周围炎性细胞上的Fas配体，被激活的Fas配体与肾小管上皮细胞表面的Fas蛋白相互作用，激活Fas相关死亡结构域蛋白(FADD)/Caspase－8信号转导通路从而导致细胞凋亡。肝细胞表面TLR4诱发失控性炎症产生的细胞毒作用亦可引起肝细胞通过FasL凋亡机制发生凋亡［14］。在人肾小管上皮细胞中TLR4以何种途径介导HBx对肾小管上皮细胞凋亡作用还需进一步研究。

目前研究认为HBx引起TLR4激活后，可启动细胞内信号转导通路，诱导特异性基因表达，分泌多种促炎症细胞因子，诱导炎症发生，促进T辅助细胞(Th)发生 Th1/Th2格局变化［15］。本研究中用ELISA方法检测了细胞培养上清中细胞因子IL－4、IFN－γ水平，发现转染HBx基因后肾小管上皮细胞分泌 IL－4、IFN－γ 异常，即 HBx 抑制了 IL－4 分泌，增强IFN－γ分泌，导致 IL－4/IFN－γ水平失衡。而细胞因子的类别及细胞因子之间的平衡对Th0细胞分化为Th1/Th2具有重要的调节作用。Th2细胞的分化依赖IL－4，而IFN－γ可以抑制Th2细胞的增生，使分化朝着Th1细胞方向发展，因此，IL－4和IFN－γ之间的平衡影响着Th1/Th2细胞之间的平衡，Th1/Th2细胞之间的失衡参与了慢性HBV感染过程［16］。根据本研究结果，HBx基因引起 IL－4、IFN－γ异常，可能由此引起 Th1/Th2细胞失衡，参与 HBV－GN的进展。

综上所述，HBx在体外转染肾小管上皮细胞后，可引起肾小管上皮细胞损伤，细胞凋亡率增加，这可能与HBx引起TLR4上调有关。HBx亦能引起一些细胞因子分泌紊乱，参与肾脏的损伤。进一步的相关机制的研究必将为临床治疗HBV－GN提供新的治疗靶点。

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