非小细胞肺癌患者外周血中肺表面活性蛋白C mRNA的表达及临床意义

李爱兰，吉兆宁

(皖南医学院附属弋矶山医院 肿瘤内科，安徽 芜湖 241001)

肺癌是当今世界上最常见的恶性肿瘤之一，浸润和转移是其恶性的标志，为患者治疗失败和死亡的主要原因，因为缺乏有效的早期诊断手段及治疗转移性肺癌的方法，其五年生存率较低。血行性播散是肺癌转移、复发的主要方式之一，肿瘤细胞出现在外周血循环中，是肿瘤血行播散和发生远处转移的预测指标之一，但由于外周循环血中的肿瘤细胞数量非常少，常规临床检查难以发现，如对其进行检测，检测方法须有较高的灵敏度和特异度，RT-PCR技术使检测外周血中的微量癌细胞成为可能。目前在肺癌早期转移的研究中缺乏较为公认的特异性分子标记物［1］。Ⅱ型肺泡上皮细胞现被认为是肺癌的祖细胞，它能够合成分泌肺表面活性蛋白C(pulmonary surfactant protein C，SP-C)，正常外周血单核细胞中不表达SP-C mRNA，其mRNA是由上皮组织和上皮组织来源的肿瘤组织中的相关基因的特异性表达，如在外周血中扩增出上皮组织特异性标志物的表达，则可表明有上皮源性的肿瘤细胞播散到间质组织外周血中，发生了微转移［2］。因此，我们选择了SP-C作为分子标记物，采用RT-PCR技术检测44例非小细胞肺癌(NSCLC)患者外周血SP-C mRNA，通过分析与临床病理特征的关系，以探讨其作为肺癌微转移标志物的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 44例非小细胞肺癌(NSCLC)患者均来源于弋矶山医院呼吸内科，病理学诊断明确，且临床影像学检查未见远处转移。其临床病理特征如下:55岁及以上36例，55岁以下8例，男性32例，女性12例，腺癌24例，鳞癌20例。低分化26例，高分化18例，TNM分期，Ⅰ+Ⅱ期患者30例，Ⅲ期患者14例。另外选择20例肺部良性疾病患者及10名健康人作为对照组。

1.2 方法 试剂与引物设计:参照Genbank，采用Primer Premier5引物设计软件设计SP-C基因内外引物，上游序列:5'-TGGTGGTCCTCATCGTCG-3'，下游序列:5'-GGAGAAGGTGGCAGTGGTAA-3'，PCR 扩增产物长度161pb。内参引物为GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)，以检测RNA的完整性，GAPDH-上游序列:5'-CGGAGTCAACGGATTGGTCGTAT-3'，GAPDH-下 游:5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'，扩增产物长度306 bp，由上海生工公司合成。

标本的收集与RNA抽提:抽取新鲜血5 ml，肝素抗凝，用淋巴细胞分离液进行有核细胞的分离，Trizol法提取有核细胞的RNA。

RNA质量检测:对所抽提的RNA行纯度分析，计算A260/A280比率，其中A260/A280比率应为1.6～1.8，并行1%琼脂糖凝胶电泳观察RNA的完整性。

cDNA第一链合成:取 RNA约1μl加入20μl反应体系中，按照试剂盒提供的条件进行逆转录。

PCR扩增:SP-C mRNA与GAPDH(内参)按照摸索好的实验条件进行。具体为:SP-C PCR反应体系25 μl，其中cDNA 3 μl，稀释后的SP-C 引物2 μl，PCR Mix 12.5 μl，再加入灭菌双蒸去离子水7.5 μl，使总体积达25μl。反应条件:94℃预变性2 min一个循环;94℃变性40 s，58°C退火40 s，72℃延伸60 s，共32个循环;最后72℃延伸5 min一个循环。

PCR产物分析:SP-C扩增产物3μl，加6×loadingbuffer 1μl混匀上样于1%琼脂糖凝胶电泳，90 V恒压，30 min，EB染色，在凝胶成像系统下拍照和分析。

1.3 统计学分析 使用STATA 15.0统计软件对资料分析，相关数据采用χ2检验进行处理。

2 结果

2.1 RNA质量检测结果 实验中所抽提的RNA A260/A280比率值在1.72～1.95之间，外周血抽提总RNA约1 000～1 500 ng，1%琼脂糖电泳，EB染色可见28 s、18 s亮带。

2.2 肺癌患者和对照组SP-C mRNA的表达 44例肺癌患者外周血中SP-C mRNA阳性26例，表达阳性率59.1%。20例良性肺疾病患者和10例健康对照者外周血中SP-C mRNA均阴性，SP-C mRNA在肺癌组与对照组中的表达差异具有统计学意义(χ2=27.33，P＜0.01)，见表 1。

2.3 外周血中SP-C mRNA表达与肺癌患者临床病理生理特征关系 44例肺癌患者中大于55岁与小于55岁的阳性率比较，差异无统计学意义(P＞0.05);男、女之间的阳性率比较，差异无统计学意义(P＞0.05);TNM分期中，(Ⅰ+Ⅱ)期与Ⅲ期之间的阳性率比较，差异有统计学意义(P＜0.05);肺癌不同病理分型中，腺癌与鳞癌之间的阳性率比较，差异有高度统计学意义(P＜0.01);低分化与高分化之间的阳性率比较，差异有高度统计学意义(P＜0.01)。见表2。

表1 NSCLC患者及对照组外周血中SP-C mRNA的表达

表2 NSCLC患者外周血中SP-C mRNA表达与肺癌患者临床病理特征的关系

3 讨论

远处转移是影响非小细胞肺癌(NSCLC)患者生存的主要因素之一。在肺癌的治疗方法中，除ⅢB及Ⅳ期之外，均应以手术治疗为主导，但即使是病理分期为Ⅰ期(T1N0M0、T2N0M0)的NSCLC患者在手术后仍可有约30%的患者早期复发，而且复发方式多为脑、骨、肺等的血行性转移，从这方面来看，说明手术时，其切除范围以外的血液中就已有隐匿或微量癌转移细胞存在。

外周血中并不含有RNA，因其对降解酶具有高度的敏感性，血液中具有肿瘤特征性的mRNA只可存在于有活性的和完整形态的肿瘤细胞中。所以，在外周血中检测到特异性的mRNA存在就可以用来说明循环中有微量癌转移细胞的存在［3］。随着RT-PCR技术的发展，使得通过外周血来检测微量癌转移细胞成为可能。本实验选择SP-C基因作为检测分子标志，用RT-PCR方法来检测肺癌患者的外周血，表明SP-C mRNA作为检测肺癌外周血微转移的分子标志物具有良好的敏感性和特异性。实验表明，NSCLC患者外周血发生微转移与患者的年龄、性别无关，与疾病TNM分期、组织病理学类型和癌细胞分化程度相关。如果在外周血中检测到癌细胞可表明癌细胞较强的转移潜能，预示着其预后欠佳。因此，综合考虑肺癌患者外周血SP-C mRNA表达情况与影像学表现，将会有助于更准确地判定肺癌患者的分期，制定更加合理的治疗方案，有助于提高治疗效果和改善预后。

SP-C是特异性的Ⅱ型细胞分泌蛋白，含有33～35个氨基酸残基，成熟的SP-C为单一性疏水性脂蛋白，1个成熟SP-C活性肽的单位相对分子质量是42 ku。SP-C相应的基因定位于人的8号染色体断臂上。肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar epithelial type Ⅱcell，AE2 cell)主要的生理功能是合成、贮存、分泌表面活性物质(PS)，在肺上皮更新的过程中和组织损伤修复的过程中起着干细胞作用，且具有跨膜转运的功能及分泌生物活性物质的能力［4－5］。肺表面活性物质主要是由脂质和蛋白质构成，具有增强免疫防御，降低肺泡气液界面表面的张力，调节气道内液体平衡等功能。其中肺表面活性物质蛋白(SP)发挥了重要的作用。SP主要有A、B、C、D 4种，其中SP-C是肺泡Ⅱ型细胞分泌的特异性表面活性蛋白。SP-C为PS中含量不足1%的非极性的表面活性蛋白，是一种肺部特有的蛋白质，且具有重要、特殊的功能。目前其主要功能之一是在呼气的过程中将非二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)脂质排出气-液界面，从而保证了脂质层的表面生理活性［6］。现在国内外研究主要集中在 SP-A、SP-D，而关于SP-C基因、蛋白的表达变化情况与肺组织疾病关系的研究报道较少。Betz等［2］研究发现，以肺表面活性蛋白mRNA作为转移分子标志物，进行了肺癌患者淋巴结的检测，在106个非异常淋巴细胞中检出了1个癌细胞，且在转移性肺腺癌患者的淋巴结中检出来其表达亦呈阳性，对照组全部为阴性，该实验显示了其作为检测肺癌发生早期转移指标的价值。

AE2细胞也可以作为抗原呈递细胞，其在一定的生理条件下能表达组织相容性复合物(MHC)Ⅱ类分子，从而具有一定的免疫作用，可分泌细胞因子、炎症介质，参与炎症细胞间的相互作用，可被看作是一类重要的免疫调节细胞，起到了肺部免疫调节和防御的作用［7－8］。由于抗原呈递细胞表面的组织相容性复合物Ⅱ类分子与抗原相结合，表达于细胞的表面，呈递给T细胞，T细胞相应活化、增殖，从而启动了抗原特异性免疫反应。肺部免疫功能及机体的全身免疫功能强弱与肿瘤的发生、发展是呈负相关的。有研究表明，老年肺的特点使得AE2细胞结构和功能产生退行性的改变，导致肺对外界致病因素的抵抗力减弱，从而易发生肺癌疾病。由于SP-C是AE2细胞分泌的特异性表面活性蛋白，如通过肺癌患者外周血中检测到其高表达，可以进一步探讨该蛋白是否影响到患者肺局部免疫及全身免疫，从而来进一步明确其是否影响肺癌患者的转移及预后。为了揭示该分子标志物作为肺癌早期转移检测指标的价值，尚需对本组患者进行随访检测。

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