AHVAC-Ⅰ对人胃癌细胞株SGC-7901生长增殖的影响及作用机制

周 珏，卢林明，张根葆

(皖南医学院 1.病理解剖学教研室;2.病理生理学教研室;3.蛇毒研究所，安徽 芜湖 241002)

蛇毒具有广泛的生物学活性，是一种天然的药用资源［1－2］。蝮蛇是我国分布最广、数量最多的一种毒蛇，蝮蛇蛇毒含有多种抗凝、抗血栓及抗肿瘤的活性成分，由于蝮蛇生长环境的不同，不同地域的蝮蛇蛇毒各组分及作用也不尽相同，本校蛇毒研究所通过改良蛇毒分离纯化技术，从皖南产蝮蛇蛇毒中提取了一种抑瘤组分Ⅰ(Agkistrodon Halysvenom antitumor component-Ⅰ，AHVAC-Ⅰ)。前期研究已证实具有高效低毒的抗凝、溶栓作用，其机制可能与影响血管内皮细胞有关。为进一步了解对肿瘤的影响，本实验以人胃癌细胞株SGC-7901为对象，观察AHVAC-Ⅰ对其生长增殖的影响并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂及药品 AHVAC-Ⅰ干冻粉由皖南医学院蛇毒研究所提供。RPMI1640细胞培养液(美国Hyclone);胎牛血清(杭州四季青公司);青霉素-链霉素溶液、胰酶消化液、CCK-8试剂盒、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(碧云天生物技术公司)。

1.2 细胞培养 人胃癌细胞株SGC-7901，购自南京凯基生物技术发展有限公司(货号:KG026)。细胞株常规培养，胰酶消化1∶2传代，培养于含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素溶液的RPMI1640中，置于5%CO2、37℃的培养箱中孵育，每隔1～2 d换液、传代，至对数增长期，收集细胞实验。

1.3 CCK-8比色法 取对数增长期的细胞，调整细胞浓度(1×104/孔)接种于96孔培养板中，5%CO2、37℃培养箱中过夜，将AHVAC-Ⅰ干冻粉溶解于培养液中，稀释、配制成各浓度AHVAC-Ⅰ(0.1、0.3、1、3、10、30、100、300 μg/ml)，设空白组、阴性对照组及阳性对照组(50μg/ml 5-Fu)，每组设4复孔;培养箱孵育24 h，每孔加20μl CCK-8溶液，孵育2 h后充分振荡，酶标仪上450 nm波长检测每孔吸光度(OD)，计算细胞生长抑制率(IR);计算公式为:IR=［1－(实验组OD－空白组OD)/(阴性对照组OD－空白组OD)］×100%;改良寇氏法计算IC50。

1.4 形态学观察

1.4.1 光镜直接观察 将细胞悬液接种于6孔培养板中(5×105/孔)，培养箱孵育过夜，加AHVAC-Ⅰ溶液孵育24 h，浓度及分组同1.3，倒置显微镜观察、拍照。

1.4.2 HE染色观察 将细胞悬液(5×105/孔)加入放置灭菌盖玻片的6孔培养板中，制备细胞爬片，培养箱孵育过夜，加AHVAC-Ⅰ溶液孵育24 h，浓度及分组同1.3，取出盖玻片，常规苏木素-伊红(HE)染色，中性树胶封片，显微镜观察、拍照。

1.5 TUNEL法 制备细胞爬片，加 AHVAC-Ⅰ溶液，浓度及分组同1.3，孵育24 h后取出爬片进行原位末端标记实验，具体实验步骤参考试剂盒说明书。光镜观察计算凋亡指数(apoptotic index，AI)，计算方法:400倍镜下随机数500个细胞，计算阳性细胞数(核为蓝黑色)，AI=阳性细胞数/细胞总数 ×100%，重复三次。

2 结果

2.1 AHVAC-Ⅰ对 SGC-7901的生长抑制作用CCK-8结果显示与阴性对照组比较，经AHVAC-Ⅰ处理24 h后，SGC-7901细胞的生长增殖明显抑制(P＜0.01)，并且呈浓度依赖性，IC50 为 58.197 μg/m l;各组吸光度及抑制率见表1。

2.2 AHVAC-Ⅰ作用于SGC-7901的形态学变化阴性对照组细胞呈多边形，贴壁生长，核分裂像较多;经AHVAC-Ⅰ处理24 h后，细胞生长受抑制，倒置显微镜下见细胞密度稀疏，随浓度增高出现悬浮、固缩等凋亡现象，高浓度时可见较多凋亡小体及细胞碎片，见图1;HE染色后细胞形态变化同上，可见凋亡细胞及凋亡小体，见图2。

2.3 AHVAC-Ⅰ诱导 SGC-7901凋亡的情况0.3μg/ml AHVAC-Ⅰ组细胞凋亡指数与阴性对照组相比无差异(P＞0.05)，浓度≥1.0 μg/ml的细胞凋亡指数与阴性对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.0 5或P＜0.01)，并呈浓度依赖性，见表2。

表1 AHVAC-Ⅰ对SGC-7901细胞的抑制作用(±s，n=4)Tab1 The inhibition effect of AHVAC-Ⅰon SGC-7901 cells(±s，n=4)

表1 AHVAC-Ⅰ对SGC-7901细胞的抑制作用(±s，n=4)Tab1 The inhibition effect of AHVAC-Ⅰon SGC-7901 cells(±s，n=4)

*P ＜0.05，＊＊P＜0.01 vs阴性对照组

组别OD(¯x±s)IR(%)空白组0.043 ±0.056－阴性对照组 0.966±0.020－阳性对照组 0.459 ±0.013 55.00 0.1μg/ml 0.988 ±0.020－2.38 0.3μg/ml 0.938 ±0.010* 3.01 1.0μg/ml 0.868 ±0.020＊＊ 10.59 3.0μg/ml 0.802 ±0.027＊＊ 17.72 10μg/ml 0.740 ±0.029＊＊ 24.49 30μg/ml 0.585 ±0.016＊＊ 41.26 100μg/ml 0.459 ±0.011＊＊ 54.94 300μg/ml 0.439 ±0.009＊＊ 57.11 F 值 576.02 P值 ＜0.01

表2 AHVAC-Ⅰ作用SGC-7901细胞24 h的凋亡指数(±s，n=3)Tab2 Apoptotic Index of SGC-7901 cells induced by AHVAC-Ⅰfor 24 h(±s，n=3)

表2 AHVAC-Ⅰ作用SGC-7901细胞24 h的凋亡指数(±s，n=3)Tab2 Apoptotic Index of SGC-7901 cells induced by AHVAC-Ⅰfor 24 h(±s，n=3)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs阴性对照组

组别凋亡指数AI(%，¯x±s)阴性对照组2.20 ±0.20 0.3μg/ml 2.47 ±0.64 1.0μg/ml 4.60 ±0.72*3.0μg/ml 9.73 ±0.50＊＊10μg/ml 26.73 ±1.33＊＊30μg/ml 69.53 ±1.62＊＊F 值 2 220.27 P值 ＜0.01

3 讨论

我国胃癌的发病率居各类肿瘤的首位，临床治疗依旧采用手术切除、术后化疗的传统方法，所用的药物多为化学合成药，副作用较大且易产生耐药。研究证实从蛇毒中分离纯化的多种活性成分，可以通过抑制肿瘤细胞的高粘附性、抑制肿瘤血管生成、直接杀伤肿瘤细胞及诱导肿瘤细胞凋亡等途径起到抗肿瘤的作用［3－5］，表现出较高的特异性和敏感性［6－8］;同时作为一类天然毒蛋白，其毒副作用较小，已成为抗肿瘤药物研制开发的重要方向和研究热点。本校蛇毒研究所从皖南蝮蛇毒中分离纯化的抑瘤组分Ⅰ(AHVAC-Ⅰ)具有抗血小板凝固、抗血栓形成、改善微循环等多种作用，同时发现其在体外可抑制白血病细胞的生长增殖，并诱导细胞凋亡;本实验进一步研究、分析了不同浓度的AHVAC-Ⅰ对人胃癌细胞株SGC-7901生长增殖及凋亡的影响。

CCK-8法显示0.3 μg/ml的 AHVAC-Ⅰ即可抑制SGC-7901细胞的生长(P＜0.05)，1～300μg/ml时细胞生长被显著抑制(P＜0.01)，抑制率随浓度增加而增加，证实AHVAC-Ⅰ可抑制SGC-7901的生长增殖，呈浓度依赖性，24 h的IC50为58.197μg/ml，且与5-Fu抗肿瘤的效果相近。镜下观察发现随药物浓度的增加，SGC-7901细胞出现缩小变圆、悬浮、核固缩、崩解等凋亡现象，HE染色后可见典型的凋亡细胞及凋亡小体。TUNEL法显示经AHVAC-Ⅰ处理24 h后SGC-7901发生凋亡，凋亡指数随药物浓度增加而增加。综上所述AHVAC-Ⅰ对SGC-7901的生长增殖具有较强的抑制作用，诱导凋亡可能是其作用机制之一。

图1 AHVAC-Ⅰ处理24 h 后SGC-7901细胞形态变化(倒置显微镜，×200)Fig1 Morphological changes of SGC-7901 cells induced by AHVAC-Ⅰ for 24 h(under inverted microscope，×200)

图2 AHVAC-Ⅰ处理24 h 后SGC-7901细胞形态变化(光镜，HE染色，×400)Fig2 Morphological changes of SGC-7901 cells induced by AHVAC-Ⅰ for 24 h(under optical microscope，HE staining，×400)

细胞凋亡是由kerr等在1972年首次提出［9］，它是指由基因控制的细胞主动发生的一种程序性的细胞死亡，对生物体的正常发育、自稳态的平衡以及各种病理过程有重要意义。许多研究旨在发现可促进肿瘤细胞凋亡且安全有效的天然抗肿瘤药用资源，其中蛇毒成分的研究比较充分，资料显示其具有抗肿瘤活性，可诱导肿瘤细胞凋亡。本研究证实皖南蝮蛇毒中提纯的AHVAC-Ⅰ可能是通过诱导凋亡来抑制肿瘤细胞的生长增殖，有望成为新一代的抗肿瘤药物应用于临床，其诱导凋亡的具体途径有待于下一步的研究和探索。

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