HPLC法测定咖啡酸及咖啡酸片的含量
2012-05-01李明霞张英芳黄书芹
李明霞，张英芳，黄书芹
(1.德州德药制药有限公司，山东 德州 253015;2.德州市立医院，山东 德州 253012)
咖啡酸为有机酸及酚类原料，其制剂咖啡酸片为止血升白细胞药，具有收缩增固微血管、提高凝血因子的功能、升高白细胞和血小板的作用。咖啡酸与咖啡酸片的质量标准分别收载于国家食品药品监督管理局局颁药品标准与卫生部颁药品标准(化学药品与制剂)第一册，均采用紫外－分光光度法(吸收系数法)测定其含量，由于紫外－分光光度法的影响因素较多，且供试品溶液制备过程较为繁琐，本文参照咖啡酸局颁药品标准中有关物质测定方法，采用高效液相外标法测定其含量，方法简便，准确。
1 仪器与试药
1.1 仪器 岛津 LC－10ATvp高效液相色谱仪，SPD－10Avp紫外检测器，Anastar色谱工作站。
1.2 试药 咖啡酸 (由德药制药有限公司提供，批号:111101、111201、111202);咖啡酸片(由德药制药有限公司提供，批号:111101、111102、111103);咖啡酸对照品(中国药品生物制品检定所，批号为110885－200102);试验用水为注射用水，甲醇为色谱纯，冰醋酸为分析纯。
2 试验方法与结果
2.1 色谱分析条件及系统适用性 色谱柱:Sepax Sapphire C18柱(4.6mm ×250mm，5μm);流动相:甲醇 －0.32% 醋酸溶液(45∶55);检测波长:323 nm;流速:1.0mL·min－1;进样量:10μL。理论板数按咖啡酸峰计算应不低于3000。
2.2 溶液的制备
2.2.1 对照品溶液的制备 取咖啡酸对照品12.5mg，精密称定，置50mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，精密量取5mL，置25mL量瓶中，加流动相稀释至刻度。
2.2.2 供试品溶液Ⅰ(咖啡酸)的制备 取咖啡酸12.5mg，精密称定，置50mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，精密量取5mL，置25mL量瓶中，加流动相稀释至刻度。
供试品溶液Ⅱ(咖啡酸片)的制备:取咖啡酸片20片，精密称定，研细，取细粉适量(约相当于咖啡酸12.5mg)，精密称定，置50mL量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，滤过，精密量取续滤液5mL，置25mL量瓶中，加流动相稀释至刻度。
2.2.3 阴性对照溶液的制备 按咖啡酸片处方比例称取辅料适量，同法制备空白溶液。
2.3 干扰试验 在上述色谱条件下，取对照品、供试品和阴性对照溶液各10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图。结果在对照品色谱峰保留时间相应的位置上，供试品溶液有响应的峰，阴性对照溶液无对应峰，对样品的测定无干扰，分离良好，见图 1、2。
图1 咖啡酸对照品色谱图
图2 阴性对照溶液色谱图
2.4 线性关系及范围 取咖啡酸对照品12.5mg，精密称定，置50mL量瓶中，用流动相溶解并稀释至刻度，作为对照品储备液。精密量取对照品储备液 1.0、3.0、5.0、7.0、9.0mL，分别置25mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，照“2.1”项色谱条件进行测定，记录色谱图，以对照品溶液浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，作线性回归，得回归方程A=47806C－5860.5，r=0.9998(n=5)。结果表明咖啡酸在 10 ～90 μg·mL－1范围内，与峰面积呈良好的线性关系。
2.5 回收率试验 分别取处方比例的咖啡酸对照品及空白辅料适量，照测定浓度的80%，100%，120%制备供试品溶液，每个浓度制备3份，照正文含量测定方法测定，将测得峰面积代入线性方程，计算供试品中咖啡酸的含量，回收率试验结果见表1。
表1 回收率试验结果
2.6 精密度试验 取线性试验中浓度为50 μg·mL－1的咖啡酸对照品溶液，重复进样6次，按咖啡酸峰面积计算得RSD=0.67%(n=6)，结果表明进样精密度良好。
2.7 重复性试验 取同一批号咖啡酸及咖啡酸片各6份，按正文方法测定，结果表明含量平均值分别为100.1%、99.6%，RSD 分别为0.86%、0.99%，表明本分析方法重复性较好。
2.8 稳定性试验 取同一供试品溶液，分别在0、2、4、6、8 h取10μL注入液相色谱仪，测定其峰面积，RSD=1.06%，表明本品溶液在8 h内稳定。
2.9 样品测定 按正文拟定方法分别测定3批咖啡酸及咖啡酸片的含量，测定结果见表2。
表2 咖啡酸及咖啡酸片样品测定结果
3 讨论
3.1 流动相、色谱柱的选择均参照咖啡酸局颁质量标准中有关物质的测定。
3.2 检测波长的选择 取对照品溶液进行紫外扫描，结果咖啡酸在323 nm波长处有最大吸收，故选择323 nm作为检测波长，可用于含量测定。
3.3 本方法线性关系试验、回收率试验、精密度等试验均良好，适用于咖啡酸及咖啡酸片的含量测定，方法简单、精密度高、结果准确可靠。
