XAF1蛋白在人肝癌组织中的表达及术后复发中的作用研究

王建军 洪来电 余争垚

[摘要] 目的 XIAP相关因子1（XIAP-Associated Factor 1，XAF1）可与XIAP直接结合并拮抗其抗凋亡作用，本文研究了XAF1在人肝细胞癌组织中的表达，并探讨了其在肝癌患者预测复发中的价值。 方法 采用免疫组化法检测38例HCC患者肝癌组织中XAF1蛋白的表达，并分析其与术后复发的关系。 结果 XAF1在人肝癌组织中表达免疫组化实验结果提示，XAF1在人肝癌组织中的表达阳性率为36.84%（14/38），在癌旁正常组织中的表达阳性率为100%（38/38），两者差异有统计学意义（P＜0.05）。24例XAF1低表达患者中，XAF1表达水平与PVTT（P=0.012）、AFP高水平（P=0.016），肿瘤大小（P=0.037）有关；Log-rank检验结果显示，XAF1低表达患者的术后1年无瘤生存率显著低于XAF1正常表达患者（P＜0.05），是影响HCC术后1年生存率的因素之一。 结论 XAF1在人体肝癌组织中表达水平低于癌旁正常组织，这可能是影响肝癌术后复发的一个潜在危险因素。

[关键词] XIAP相关因子1；肝肿瘤；复发

[中图分类号] R735.7[文献标识码] A[文章编号] 1673-9701（2012）01-001-02

Role of XAF1 in tumor recurrence of patients with hepatocellular carcinoma treated with hepatectomy

WANGJianjun HONGLaidian YUZhengyao

Department of General Surgery, Chun'an County First People's Hospital, Chun'an 311700, China

[Abstract] Objective XIAP-associated factor 1 (XAF1) is a putative tumor suppressor that exerts its proapoptotic effects through both caspase-dependent and–independent means. In this study we investigated the expression XIAP-associated factor 1 (XAF1) in human hepatocellular carcinoma (HCC) and its mechanism of post-surgical recurrence of patients with HCC. Methods Immunohistochemistry was used to detect the expression of XAF1 in 38 patients with HCC after hepatectomy, and the relationship between the expression of XAF1 and the post-surgical recurrence of patients with HCC was analyzed by bioinformatics. Results Immunohistochemisitry results showed that the positive ratio was 36.84% (14/38) and 100% (38/38) in human HCC tumor tissues and corresponding normal liver tissues significantly, and there was significant difference between them (P＜0.05). HCC patients with low expression of XAF1 were associated with PVTT (P=0.012), highalpha-fetoprotein (AFP) level (P=0.016) and tumor size (P=0.037) , respectively. It was demonstrated that the 1-year tumor-free survival rate of normal XAF1 expression patients was significantly higher than that of low XAF1 expression patients (P＜0.05), suggesting that low XAF1 expression may be associated with the postoperative recurrence of HCC patients. Conclusion The expression level of XAF1 in HCC tumor tissue is lower than that in corresponding normal liver tissues. It may be a potential risk factor for the recurrence of patients with HCC after hepatectomy.

[Key words] XAF1; Liver neoplasm; Recurrence

在全世界肿瘤发生率排名中，肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）排名第五位，占死亡率的第四位，已成为常见的肝脏恶性肿瘤[1，2]。然而中国慢性乙肝携带人群数超过人口10％，中国是全球HCC最高发的地区之一。目前，接受医治后的患者复发例数较多，也已成为影响患者生存的不利因素[3]。因此，学术界一直致力于寻求对肝癌术后复发具有预测价值的生物学标记物。本文以新近发现的X染色体相关凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）的相关因子1（XIAP-associated factor 1，XAF1）作为研究对象，该因子具有抑制肿瘤作用，探讨其在原发性HCC中控制和抑制复发的价值。

1 材料与方法

1.1 一般资料

研究对象根据下列选取标准，获得2004年1月～2007年1月行手术治疗的肝癌患者石蜡标本38份：（1）术后均经病理学证实确诊为肝细胞癌患者；（2）术前均未接受任何抗肿瘤治疗；（3）所有病例无合并HCV感染者，均为单一HBV感染患者；（4）均在随访或者术前获取病理学资料，包括肿瘤体积、肿瘤病灶数目等；（5）均为中国汉族人种。38例患者其中男34例，女4例，平均年龄（47.0±2.3）岁，以上患者均获得随访。随访截止日期2008年12月31日。

1.2 免疫组织化学

采用北京中杉金桥生物技术公司生产二氨基联苯胺、M二步法免疫组化试剂盒。采用二甲苯脱蜡、梯度酒精水化、38例HCC的石蜡标本4 μm厚度切片；浓度为3％的双氧水孵育10 min后，抗原热修复在pH6.0的枸橼酸缓冲液中完成，加热在95℃左右微波炉进行15 min；自然冷却后，滴加兔抗人XAF1多克隆抗体（美国USBiological公司）孵育4 ℃过夜；第2天复温后在二抗孵育25 min；根据流程DAB显色、苏木素复染、脱水、透明、封片。以磷酸缓冲液（Phosphate Buffer Solution，PBS）对照，胞浆中见棕黄染色。结果依据阳性细胞所占百分比及着色深浅进行判定，阳性细胞数计分：＜5%为0分，5%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞76%为4分。细胞着色强度计分：无显色：0分，淡黄色：1分，棕黄色：2分，棕褐色：3分。2项评分总和为总积分，0～1分为阴性（-），2～3分为弱阳性（＋），≥4分为阳性（++）[4]。

1.3 统计学方法

应用SPSS15.0统计学软件，XAF1表达与临床病理资料之间的相关性采用χ2（卡方）检验，无复发生存率分析采用Kaplan-Meier法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 XAF1在肝组织中的表达情况

免疫组化结果显示，XAF1蛋白在38例（100%，38/38）人肝癌癌旁正常组织中均呈现高表达；而在肝癌组织中的表达阳性率为36.84%（14/38），两者差异具有统计学意义（P＜0.05）。本研究将24例XAF1蛋白低表达肝癌患者归类为XAF1低表达组（封三图1），另14例XAF1蛋白在肝癌组织及对应癌旁正常肝组织中的表达基本相同，将其归类于XAF1正常组（封三图1）。实验结果中，未检测到XAF1表达明显高于健康肝组织的状况。

2.2 XAF1蛋白表达水平与临床病理因素的相关性

采用χ2（卡方）检验分析了XAF1表达与患者临床病理参数之间的相关性，比较得到XAF1的低表达与PVTT（P=0.012）、AFP高水平（P=0.016），肿瘤大小（P=0.037）均有关，而与性别、年龄、肿瘤数量、组织学分级无关。见表1。

2.3 影响肝癌术后复发的危险因素分析

24例XAF1蛋白低表达肝癌患者中，18例（75.0%，18/24）术后1年复发，6例（25.0%，6/24）未复发；14例XAF1蛋白正常表达肝癌患者中，6例（42.9%，6/14）术后1年复发，8例（57.1%，8/14）未复发。采用Kaplan-Meier法分析无复发生存率，结果如表1所示，XAF1蛋白的低表达与复发显著相关（P=0.048）。

3 讨论

最新发现的肿瘤抑制因子X是存在染色体17p13区域的染色体相关凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP）的相关因子1（XIAP-associated factor 1，XAF1）。研究表明，XAF1蛋白的表达缺失或降低往往影响肿瘤的进展和预后。Byun等[5]发现XAF1蛋白的表达缺失不仅与胃癌的进展有关，而且和一些癌症患者的无瘤生存率及总体生存率也有关[6]。日本学者对24例HCC切除患者的肝癌组织标本进行免疫组织化学检测后发现，XAF1的表达与肿瘤细胞的凋亡显著相关[7]，但鲜有相关报道。

此外，Chung等[8]报道在结肠癌中XAF1蛋白的表达下调具有肿瘤特异性，且与肿瘤进展及病理分级有关。Sakemi等[7]发现肝癌组织中XAF1的表达水平与肿瘤分化相关，低分化肝癌组织中XAF1的表达水平远低于中高分化肝癌组织，提示XAF1蛋白的表达水平可能与肝癌患者的临床病理参数有关。本实验结果显示，肝癌组织中XAF1蛋白表达水平与患者PVTT、术前AFP水平、肿瘤大小等临床病理指标之间存在相关性。单因素分析结果表明，患者术前AFP水平、肿瘤大小、肿瘤数量均与肿瘤术后复发相关，该结果与最新研究认为临床组织学因素与肿瘤术后复发存在相关性一致[9]。本研究结果表明，XAF1在预测肝癌术后复发方面具有潜在的应用价值，但要应用于临床还需大样本、前瞻性、多中心的研究进一步加以证实。

[参考文献]

[1]Bosch FX，Ribes J，Borras J. Epidemiology of primary liver cancer[J]. Semin Liver Dis，1999，19（3）：271-285.

[2]Kew MC. Epidemiology of hepatocellular carcinoma[J]. Toxicology，2002， 181-182：35-38.

[3]Yoo HY，Patt CH，Geschwind JF，et al. The outcome of liver transplantation in patients with hepatocellular carcinoma in the United States between 1988 and 2001：5-year survival has improved significantly with time[J]. J Clin Oncol，2003，21（23）：4329-4335.

[4]Kempkensteffen C，Fritzsche FR，Johannsen M，et al. Down-regulation of the pro-apoptotic XIAP associated factor-1（XAF1） during progression of clear-cell renal cancer[J]. BMC Cancer，2009，9：276.

[5]Byun DS，Cho K，Ryu BK，et al. Hypermethylation of XIAP-associated factor 1，a putative tumor suppressor gene from the 17p13.2 locus，in human gastric adenocarcinomas[J]. Cancer Res，2003，63（21）：7068-7075.

[6]Kempkensteffen C，Hinz S，Schrader M，et al. Gene expression and promoter methylation of the XIAP-associated Factor 1 in renal cell carcinomas：correlations with pathology and outcome[J]. Cancer Lett，2007， 254（2）：227-235.

[7]Sakemi R，Yano H，Ogasawara S，et al. X-linked inhibitor of apoptosis（XIAP）and XIAP-associated factor-1 expressions and their relationship to apoptosis in human hepatocellular carcinoma and non-cancerous liver tissues[J]. Oncol Rep，2007，18（1）：65-70.

[8]Chung SK，Lee MG，Ryu BK，et al. Frequent alteration of XAF1 in human colorectal cancers：implication for tumor cell resistance to apoptotic stresses[J]. Gastroenterology，2007，132（7）：2459-2477.

[9]Zhang Q，Chen X，Zhou J，et al. CD147，MMP-2，MMP-9 and MVD-CD34 are significant predictors of recurrence after liver transplantation in hepatocellular carcinoma patients[J]. Cancer Biol Ther，2006，5（7）：808-814.

（收稿日期：2011-04-29）