合欢花多酚的提取及对亚硝酸盐的清除作用

2012-04-29袁建梅，汪应灵，李万里

湖北农业科学 2012年14期

袁建梅，汪应灵，李万里

摘要：通过单因素试验和正交试验优化了合欢花多酚的提取工艺，考察了料液比、乙醇体积分数、提取时间、提取温度对合欢花多酚提取率的影响及多酚对亚硝酸盐的清除作用。结果表明，各因素影响的大小顺序为乙醇体积分数＞提取时间＞提取温度＞料液比；提取的最佳工艺条件为料液比１∶２５（ｍ／Ｖ，ｇ∶ｍＬ），乙醇体积分数５０％，提取时间２．０ｈ，提取温度７０ ℃，在此条件下，合欢花多酚提取率为２．５９％；当多酚浓度达到６．０ μｇ／ｍＬ时，对亚硝酸盐的清除率为７３．９％。

关键词：合欢花；多酚；提取工艺；亚硝酸盐

中图分类号：Ｑ９４９．７５１．９；Ｒ２８４．２文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）14－3056-03

Extraction of Polyphenol from Flower of Albizia julibrissin and Its Nitrite

Scavenging Ability

ＹＵＡＮＪｉａｎ－ｍｅｉ，ＷＡＮＧＹｉｎｇ－ｌｉｎｇ，ＬＩＷａｎ－ｌｉ

（ＳｃｈｏｏｌｏｆＢａｓｉｃＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＸｉｎｘｉａｎｇＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉｎｘｉａｎｇ４５３００３，Ｈｅｎａｎ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＳｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｔｅｓｔｓａｎｄｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｄｅｓｉｇｎｗａｓａｐｐｌｉｅｄｔｏｏｐｔｉｍｉｚｅｔｈｅｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｏｆｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｆｒｏｍｆｌｏｗｅｒｏｆＡｌｂｉｚｉａｊｕｌｉｂｒｉｓｓｉｎ．Ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｓｏｌｉｄｔｏｌｉｑｕｉｄｒａｔｉｏ，ｖｏｌｕｍｅｆｒａｃｔｉｏｎｏｆｅｔｈａｎｏｌ，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｉｍｅ，ａｎｄｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎｔｈｅｙｉｅｌｄｏｆｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ａｎｄｔｈｅｎｉｔｒｉｔｅｓｃａｖｅｎｇｉｎｇａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｗａｓｅｖａｌｕａｔｅｄ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｉｎｆｌｕｅｎｃｅｏｆｆａｃｔｏｒｓｏｎｔｈｅｙｉｅｌｄｏｆｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｒａｎｋｅｄａｓｖｏｌｕｍｅｆｒａｃｔｉｏｎｏｆｅｔｈａｎｏｌ＞ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｉｍｅ＞ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ＞ｓｏｌｉｄｔｏｌｉｑｕｉｄｒａｔｉｏ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍｕｍｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄａｓｆｏｌｌｏｗｓ，ｓｏｌｉｄｔｏｌｉｑｕｉｄｒａｔｉｏ，１∶２５（ｍ／Ｖ，ｇ∶ｍＬ）；ｖｏｌｕｍｅｆｒａｃｔｉｏｎｏｆｅｔｈａｎｏｌ，５０％；ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇｔｉｍｅ，２ｈ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，７０ ℃．Ｔｈｅｙｉｅｌｄｏｆｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｕｎｄｅｒｔｈｅｓｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｗａｓ２．５９％．Ｔｈｅｓｃａｖｅｎｇｉｎｇｒａｔｅｏｆｎｉｔｒｉｔｅｗａｓ７３．９％ｗｈｅｎｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｗａｓ６ μｇ／ｍＬ．

Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｆｌｏｗｅｒｏｆＡｌｂｉｚｉａｊｕｌｉｂｒｉｓｓｉｎ；ｐｏｌｙｐｈｅｎｏｌ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；ｎｉｔｒｉｔｅ

合欢花为豆科植物合欢（ＡｌｂｉｚｚｉａｊｕｌｉｂｒｉｓｓｉｎＤｕｒａｚｚ．）的干燥花序［１］，是一种药食同源植物，主要生长在华东、华南、西南的路旁、林边及山坡上，具有解郁安神、和络止痛之功效，治肝郁胸闷、忧而不乐、心神不安、忧郁失眠［２，３］。合欢花含有多酚、多糖等多种活性成分，多酚的分子结构中有多个酚羟基，具有独特的药理和生理活性，可以抗氧化、抗衰老、镇静、防癌抗癌、抗辐射、预防心血管疾病等［４－６］，此外，多酚对亚硝酸盐也有一定的清除作用［７］。然而，已报道的对合欢花多酚的提取及其对亚硝酸盐的清除作用的研究较少。

采用乙醇提取法［８，９］考察了合欢花多酚提取的主要影响因素，优化了提取的工艺条件，探讨了合欢花多酚对亚硝酸盐的清除作用，为开发利用合欢花的药用和保健功能提供科学依据。

１材料与方法

１．１材料

１．１．１原料与试剂合欢花购自新乡市张仲景大药房；没食子酸对照品购自中国食品药品检定研究所，批号１１０８３１－２００８０３；１ｍｏｌ／ＬＦｏｌｉｎ－Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ试剂购自天津市光复精细化工研究所；石油醚、无水乙醇、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺均为分析纯。

１．１．２仪器与设备７５２型紫外可见分光光度计购自上海菁华科技仪器有限公司，ＨＨ－４型数显恒温水浴锅购自常州国华电器有限公司，ＳＢＨ－ＩＩ循环水式真空泵购自郑州长城科工贸有限公司，ＢＳ２４４电子分析天平购自德国赛多利斯公司，Ｒ２０６Ｄ旋转蒸发器购自上海申生科技有限公司。

１．２方法

１．２．１工艺流程合欢花多酚提取的工艺流程为：合欢花→粉碎→用石油醚脱脂→用乙醇提取→抽滤→滤液→定容→测定多酚浓度。

１．２．２单因素试验选择乙醇为提取剂，将提取次数确定为溶剂提取法常用的２次，选择乙醇体积分数、料液比、提取时间、提取温度４个影响多酚提取率的因素进行单因素试验。

１）乙醇体积分数对多酚提取率的影响。准确称取２．００００ｇ合欢花粉末５份，分别用４０ｍＬ体积分数为４０％、５０％、６０％、７０％、８０％的乙醇在６０ ℃水浴中提取１．０ｈ，提取２次，测定多酚提取率。

２）料液比对多酚提取率的影响。准确称取２．００００ｇ合欢花粉末５份，分别加入体积分数为５０％的乙醇２０、３０、４０、５０、６０ｍＬ，使料液比分别为１∶１０、１∶１５、１∶２０、１∶２５、１∶３０（ｍ／Ｖ，ｇ∶ｍＬ，下同），在６０ ℃水浴中提取１．０ｈ，提取２次，测定多酚提取率。

３）提取时间对多酚提取率的影响。准确称取２．００００ｇ合欢花粉末５份，用４０ｍＬ体积分数为５０％的乙醇在６０ ℃水浴中分别提取０．５、１．０、２．０、３．０、４．０ｈ，提取２次，测定多酚提取率。

４）提取温度对多酚提取率的影响。准确称取２．００００ｇ合欢花粉末4份，分别在５０、６０、７０、８０ ℃水浴中，用４０ｍＬ体积分数为５０％的乙醇提取２．０ｈ，提取２次，测定多酚提取率。

１．２．３正交试验在单因素试验的基础上，以料液比、乙醇体积分数、提取时间、提取温度为４种因素，取各种因素的３个水平进行Ｌ９（３４）正交试验，测定合欢花的多酚提取率，正交试验的因素与水平见表１。

１．２．４合欢花多酚浓度的测定［１０］

１）标准品溶液的配制。准确称取０．１１７６ｇ没食子酸，用去离子水溶解并定容至１００ｍＬ，准确移取５ｍＬ至５０ｍＬ容量瓶，并用去离子水定容，制得１１７．６ μｇ／mＬ没食子酸溶液。

２）标准曲线的绘制。准确移取０、０．１０、０．２０、０．２５、０．３０、０．４０、０．５０ｍＬ１１７．６ μｇ／Ｌ没食子酸溶液于１０ｍＬ容量瓶，分别加入１．００ｍＬＦｏｌｉｎ－Ｃｉｏｃａｌｔｅｕ试剂，立即混匀，再分别加入２．５０ｍＬ７５ｇ／ＬＮａ２ＣＯ３，用去离子水定容，在５０ ℃反应２ｈ，以试剂空白为参比溶液，在７６０ｎｍ波长处测定吸光度。根据所测数据求得标准方程为：＝０．１２９２c＋０．０１６１，相关系数ｒ＝０．９９９９，式中Ａ为吸光度，c为没食子酸浓度（μｇ／ｍＬ）。在没食子酸浓度为１.176～5.880 μｇ／ｍＬ时，浓度与吸光度呈良好的线性关系。

３）多酚浓度的测定。准确称取合欢花粉末２．００００ｇ，在不同条件下提取，抽滤提取液，合并滤液，滤液经旋转蒸发器浓缩至３０ｍＬ左右，用体积分数为６０％的乙醇定容至１００ｍＬ。准确吸取１．００ｍＬ提取液于１０ｍＬ容量瓶中稀释１０倍，再准确吸取１．００ｍＬ稀释后的提取液于１０ｍＬ容量瓶中，测定吸光度，利用标准方程求得多酚浓度c。

多酚提取率＝×１００％

式中，c为多酚浓度，μｇ／ｍＬ；Ｖ为提取液体积，ｍＬ；Ｎ为样品稀释倍数；ｍ为未脱脂前原料的质量，ｇ。

１．２．５合欢花多酚对亚硝酸盐的清除试验参考盐酸萘乙二胺比色法［１１］测定。准确移取２．００ｍＬ１０ μｇ／ｍＬＮａＮＯ２溶液于５０ｍＬ容量瓶中，再加入不同体积的合欢花多酚提取液，使终浓度分别为０．４、０．６、０．８、１．２、１．６、２．０、２．４、３．６、４．８和６．０ μｇ／ｍＬ，摇匀后避光反应３０ｍｉｎ，然后加入２．００ｍＬ４ｇ／Ｌ对氨基苯磺酸，摇匀静置５ｍｉｎ，加入１ｍＬ２ｇ／Ｌ盐酸萘乙二胺，摇匀，加去离子水定容，静置１５ｍｉｎ，以试剂空白为参比溶液，在５４０ｎｍ处测定吸光度，按照下式计算清除率：清除率＝［（Ａ对照－Ａ样品）／Ａ对照］×１００％，式中，Ａ对照为不加合欢花多酚提取液的吸光度；Ａ样品为添加合欢花多酚提取液的吸光度。

２结果与分析

２．１单因素试验结果

２．１．１乙醇体积分数对多酚提取率的影响从图１可知，多酚提取率先随着乙醇体积分数的增大而增大，当乙醇体积分数达到５０％时多酚提取率最高，而乙醇体积分数再继续增大时，提取率呈下降趋势。可能是因为当乙醇体积分数较低时糖类等水溶性物质溶出，影响多酚溶出，随着乙醇体积分数增大，溶剂极性与合欢花多酚极性相似，使提取率增加，当乙醇体积分数再继续增大时，溶剂与合欢花多酚极性相差较远，而且其他脂溶性物质溶出，影响测定，所以初步确定体积分数为５０％的乙醇是较为理想的提取剂。

２．１．２料液比对多酚提取率的影响由图２可知，多酚提取率随料液比的减小而增大，当料液比达到１∶２０后，多酚提取率趋于平稳。料液比越小，浓缩时间越长，多酚被氧化的几率越大，综合考虑多酚提取率、溶剂用量及能耗，选择料液比为１∶２０。

２．１．３提取时间对多酚提取率的影响由图３可知，随着提取时间的延长，多酚提取率先增加，当提取时间超过２．０ｈ后多酚提取率略有下降，可能是提取时间太长使得部分多酚被氧化，而且提取时间长使得能耗增加，所以２．０ｈ为适宜的提取时间。

２．１．４提取温度对多酚提取率的影响由图４可知，随着提取温度的升高，多酚提取率先升高，当提取温度达到７０ ℃时提取率最高，提取温度进一步升高提取率反而下降。由于多酚含有多个酚羟基，其在高温下化学性质活泼，可以发生氧化、缩合等化学反应，因此高温使多酚的提取率降低，而且随着提取温度的升高，多酚易氧化变性，所以７０ ℃是较适宜的提取温度。

２．２正交试验结果

由表２可知，Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ４种因素对合欢花多酚提取率影响的主次顺序为Ｂ＞Ｃ＞Ｄ＞Ａ，即乙醇体积分数＞提取时间＞提取温度＞料液比；各因素的最优组合为Ａ３Ｂ２Ｃ２Ｄ２，即料液比１∶２５，乙醇体积分数５０％，提取时间２．０ｈ，提取温度７０ ℃，其结果与单因素结果基本一致。

在正交试验得出的最佳提取条件下进行３次试验，合欢花多酚提取率分别为２．５８％、２．５９％、２．６１％，平均值为２．５９％，高于单因素试验和正交试验中所有试验组合的提取率，而且重现性好，表明该工艺稳定可行。

２．３合欢花多酚对亚硝酸盐的清除作用

合欢花多酚与维生素Ｃ（ＶＣ）对ＮＯ２－的清除作用见图５。由图５可知，合欢花多酚提取液对ＮＯ２－有明显的清除作用，清除率随着合欢花多酚浓度的增加而增加，当多酚浓度达到６．０ μｇ／ｍＬ时清除率为７３．９％；合欢花多酚对ＮＯ２－的清除率不及ＶＣ，而且浓度越小，两者的清除率差别越大。

３结论

１）通过单因素试验及正交试验对合欢花多酚提取工艺条件进行优化，结果表明，影响合欢花多酚提取率的主次顺序为：乙醇体积分数＞提取时间＞提取温度＞料液比；最优工艺条件为料液比１∶２５，乙醇体积分数５０％，提取时间２．０ｈ，提取温度７０ ℃，在此条件下，多酚提取率为２．５９％。

２）合欢花多酚提取液对ＮＯ２－有明显的清除作用，当多酚浓度达到６．０ μｇ／ｍＬ时清除率为７３．９％，其清除率不及维生素Ｃ。

参考文献：

［１］周凤琴，张照荣，鲍积强，等．合欢花及其混淆品山合欢花鉴别［Ｊ］．时珍国医国药，１９９９，１０（３）：１９６－１９７．

［２］李作平，张嫚丽，毛知娟，等．中药合欢花抗抑郁活性部位的初步筛选研究［Ｊ］．时珍国医国药，２００６，１７（８）：１３８８－１３８９．

［３］李作平，赵丁，任雷鸣，等．合欢花抗抑郁作用的药理实验研究初探［Ｊ］．河北医科大学学报，２００３，２４（４）：２１４－２１６．