对二氯苯对湿地土壤细菌群落多样性的影响

徐文品 丁成 杨春生 朱光灿 杨唐仪

摘要：利用聚合酶链式反应－变性梯度凝胶电泳（ＰＣＲ－ＤＧＧＥ）考查了对二氯苯胁迫对湿地土壤细菌群落多样性的影响。通过不同培养时间（４、１８和４５ ｄ）和不同培养浓度（１２０、２４０、３６０和６００ ｍｇ／ｋｇ）对二氯苯污染下湿地土壤细菌群落基因组的变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）多样性分析。结果表明，各处理下的土壤细菌群落多样性在不同处理时间有明显差异。培养初期对二氯苯对土壤细菌群落抑制作用非常显著，土壤细菌中某些群落的生长受到抑制；不同处理在处理后期差异很小。在土壤培养初期，含对二氯苯２４０ ｍｇ／ｋｇ的培养基上出现一条新增条带，为对照和低浓度对二氯苯土壤所没有，说明土壤中存在对二氯苯生长优势菌。

关键词：变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ）；对二氯苯；湿地土壤细菌菌群；多样性

中图分类号：Ｑ９３５文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）18－4134-04

Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ １，４－Ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ ｏｎ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉａ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ ｉｎ Ｗｅｔｌａｎｄ Ｓｏｉｌ

ＸＵ Ｗｅｎ－ｐｉｎ１，２，ＤＩＮＧ Ｃｈｅｎｇ1，２，ＹＡＮＧ Ｃｈｕｎ－ｓｈｅｎｇ１，２，ＺＨＵ Ｇｕａｎｇ－ｃａｎ３，ＹＡＮＧ Ｔａｎｇ－ｙｉ１，２

（１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ， Ｊｉａｎｇｓｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｚｈｅｎｊｉａｎｇ ２１２０１３，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ；

２．Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ， Ｙａｎｃｈｅｎｇ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｙａｎｃｈｅｎｇ ２２４０５１，Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ；

３．Ｙａｎｃｈｅｎｇ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ｔｅｓｔ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｙａｎｃｈｅｎｇ ２２４０５１， Ｊｉａｎｇｓｕ，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ １，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ（１２０，２４０，３６０ ａｎｄ ６００ ｍｇ／ｋｇ） ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ （４， １８ ａｎｄ ４５ ｄ） ｏｎ ｗｅｔｌａｎｄ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｕｓｉｎｇ ＰＣＲ－ＤＧＧＥ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｅａｃｈ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ １，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ on ｇｅｎｅｔｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｓｏｉｌ ｂａｃｔｅｒｉａ differed ａｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｒｅａｔｉｎｇ ｔｉｍｅ． Ｉｎ ｅａｒｌｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｅｒｉｏｄ， ｓｏｉｌ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ ｗａｓ ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ． Ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ａｍｏｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ ｉｎ ｌａｔｅｒ ｐｅｒｉｏｄ ｗａｓ ｌｉｔｔｌｅ． Ｉｎ ｅａｒｌｙ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｅｒｉｏｄ， ａ ｎｅｗ ｍｅｄｉｕｍ ｂａｎｄ ｅｍｅｒｇｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｏｆ ２４０ ｍｇ／ｋｇ ｏｆ 1，4－ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ， indicating ｔｈａｔ ｔｈｅｒｅ ｗｅｒｅ ｓｐｅｃｉａｌ ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｐｅｃｉｅｓ resistant to 1，4－ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ ｅｘｉｓｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｓｏｉｌ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ＤＧＧＥ； １，４－ｄｉｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｅｎｅ； ｗｅｔｌａｎｄ ｓｏｉｌ ｂａｃｔｅｒｉａ ｃｏｍｍｕｎｉｔｉｅｓ； ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ

土壤微生物在土壤生态中扮演了重要角色［１］，并且参与地球生物生态系统的化学循环，进行污染物质的降解［２，３］。但是由于土壤微生物个体微小、数量众多、土壤环境条件复杂等原因，用常规的分离培养法很难全面有效地评估土壤中微生物群体多样性及环境污染对土壤微生物的影响，极大地限制了人们对土壤微生物的认识［４］。伴随分子生物学技术在环境科学领域的不断应用，不经传统培养，直接从土壤中抽取出土壤微生物总ＤＮＡ，利用微生物遗传多样性及区系基因变化来进行污染物环境效应的评价，正在被广泛采用［５－７］。

研究排除其他因素，通过提取湿地土壤细菌群落总ＤＮＡ，经ＰＣＲ扩增、变性梯度凝胶电泳（ＤＧＧＥ），获得土壤细菌群落１６Ｓ ｒＤＮＡ Ｖ３序列分布，以此研究对二氯苯对土壤细菌群落多样性的影响。旨在为更直接更可靠地反映对二氯苯胁迫下湿地土壤细菌群落的组成情况，评估污染条件下土壤微生物的多样性。

１材料与方法

１．１供试土壤

供试土壤取自盐城海滨湿地土壤，无人为污染。收集１０～２０ ｃｍ处新鲜土壤，室内阴干，研磨，充分混匀，过４０目筛。

１．２试验设计

试验选择２０ ｃｍ × ４０ ｃｍ的塑料桶，桶内加入２ ｋｇ土壤，加入适量去离子水，使水面浸过土壤１～２ ｃｍ。桶内加入配制好的对二氯苯母液，使桶内对二氯苯浓度分别为０、１２０、２４０、３６０和６００ ｍｇ／ｋｇ，每组３次重复，室温２０ ℃培养。培养过程中不断补水，保证水位高于土壤１～２ ｃｍ。分别在第四天、第１８天和第４５天时，从桶内０～１０ ｃｍ深度处取土样１０ ｇ，采集后的土壤样品－２０ ℃保存。

１．３土壤中细菌群落ＤＮＡ的提取

２ ｇ土壤样品加０．２５ ｇ直径０．１ ｍｍ 玻璃珠，再加２ ｍＬ ０．１ ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ ８．０磷酸缓冲液，混匀５ ｍｉｎ，室温３ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心２ ｍｉｎ；提上清液，室温１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ，弃上清液，加入３７０ μＬ消化液（１００ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣl， １００ ｍｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ， １００ ｍｍｏｌ／Ｌ磷酸钠，１．５ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＣｌ，１％ ＣＴＡＢ，ｐＨ ８．０），３０ μＬ １０％ ＳＤＳ，１０ μＬ溶菌酶 ，４６ ℃水浴１ ｈ，加１０ μＬ蛋白酶Ｋ（２０ ｍｇ／ｍＬ）水浴４ ｈ；加５００ μＬ氯仿、苯酚混合物，混匀１０ ｍｉｎ，室温１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心，留上清液，加等体积氯仿－异戊醇 （２４∶１，Ｖ／Ｖ） 混匀１０ ｍｉｎ；室温８ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心 ５ ｍｉｎ，留上清液，加醋酸钠 ３０ μＬ １２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１５ ｍｉｎ，加１ ｍＬ ７０％ 乙醇，室温１０ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心 ５ ｍｉｎ；弃上清液，倒置风干，加５０ μＬ ｐＨ ８．０ ＴＥ缓冲液。取一定量样品进行１％的琼脂糖凝胶电泳，检测土壤细菌群落总ＤＮＡ 的提取质量［８］。

１．４ＰＣＲ扩增

扩增反应体系：１０×ＰＣＲ缓冲液５ μＬ，ＭｇＣｌ２（２５ ｍｍｏｌ／Ｌ） ４ μＬ，ｄＮＴＰ ２ μＬ，上下游引物各１．５ μＬ，模板ＤＮＡ １ μＬ，Ｔａｑ酶 （１０ ０００ Ｕ／ｍＬ） ０．５ μＬ，加去离子水至50 μＬ。反应条件为：９５ ℃预变性５ ｍｉｎ；９４ ℃变性１ ｍｉｎ，５４ ℃退火１ ｍｉｎ，７２ ℃延伸１ ｍｉｎ，共进行３０个循环；７２ ℃延伸１0 ｍｉｎ。ＰＣＲ反应在Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＡＧ公司的２２３３１型ＰＣＲ仪上进行。反应结束后取５ μＬ反应液在１％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。用于１６Ｓ ｒＤＮＡ的ＰＣＲ扩增反应的引物序列为：３３８Ｆ（ＣＣＴＡＣＧＧＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ）和５１８Ｒ（ＡＴＴＡＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＴＧＧ）。

１．５变性梯度凝胶电泳和染色

ＰＣＲ产物加入到８％（ｍ／Ｖ）聚丙烯酰胺凝胶中，凝胶的变性范围为４０％～６０％。利用ＤＧＧＥ－１Ｂ型电泳系统，在６０ ℃、１５０ Ｖ、１×ＴＡＥ Ｂｕｆｆｅｒ下电泳３３０ ｍｉｎ。电泳结束后，用固定液（１０％冰醋酸）固定凝胶２０ ｍｉｎ，用去离子洗涤凝胶3次，每次２ ｍｉｎ，取出凝胶板竖起控水１５ ｓ，将洗后的凝胶浸泡在染色液（含０．１５％硝酸银和１５０ μＬ甲醛的混合液）中２０ ｍｉｎ，然后取出凝胶，在去离子水中浸洗１０ ｓ，立即浸泡在显影液（含２．５％无水碳酸钠和２５ μＬ甲醛的混合液）中，缓慢地摇晃至条带完全显现。将凝胶置于中止液（０．５ ｍｏｌ／Ｌ ＥＤＴＡ－Ｎａ２）中浸泡１０ ｍｉｎ，再用去离子水浸洗凝胶３次，取出凝胶竖起控水［９］。

１．６指纹图谱生物信息学分析

采用Ｗａｒｄ法计算各样品间的相似指数，ＤＧＧＥ指纹图谱分析借助于Ｂｉｏ－Ｒａｄ公司的凝胶成像系统进行条带判读，以配套软件Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ进行迁移率、强度、面积计算，并计算样品间的相似指数、绘制泳道间遗传图。

２结果与分析

２．１对二氯苯处理４ ｄ后湿地土壤细菌群落总ＤＮＡ的ＤＧＧＥ分析

图１为不同浓度对二氯苯处理土壤４ ｄ后土壤细菌群落ＤＧＧＥ分析结果。由图1可知，试验初期，不同浓度对二氯苯胁迫下湿地土壤细菌群落的基因条带出现较明显的差别。与对照相比，低浓度对二氯苯胁迫下条带变化不大，但其中条带ａ、ｂ亮度变暗消失，条带ｃ、ｄ亮度增加。表明湿地土壤中大多数细菌群落对低浓度对二氯苯有一定的耐受性，基本不受影响，甚至对某类微生物具有一定的刺激作用，产生新条带，如条带ｅ。而３６０ ｍｇ／ｋｇ时，某些微生物对较高对二氯苯胁迫较为敏感，数量大大降低，达到ＤＧＧＥ分辨率下限。电泳图谱泳道间的遗传簇关系（图２）同样印证了上述结果，在图２中，对二氯苯浓度为１２０ ｍｇ／ｋｇ时与对照最为接近，第３、第４和第５泳道则与对照的相似性为５７．８％～７５．０％，较处理初期时明显降低。随着土壤中对二氯苯浓度的增加，土壤中细菌群落基因多样性受到的影响也逐渐增强，到土壤对二氯苯浓度为２４０ ｍｇ／ｋｇ时，整个泳道条带出现明显差别。值得注意的是，在土壤处理４ ｄ时，２４０ ｍｇ／ｋｇ对二氯苯浓度下，出现一条新增条带，而对照及其他浓度下土壤都没有，说明土壤中可能有在对二氯苯较高浓度下良好生长的微生物种。

２．２对二氯苯处理１８ ｄ土壤细菌群落总ＤＮＡ的ＤＧＧＥ分析

图３为不同浓度对二氯苯处理１８ ｄ土壤中细菌群落ＤＧＧＥ分析结果。由图3可知，在处理１８ ｄ时，与对照相比，１２０ ｍｇ／ｋｇ对二氯苯胁迫与对照土壤的细菌群落有７７．４％的相似性，再次说明湿地土壤中大多数细菌对对二氯苯有耐受性，另一些细菌则受到了抑制，表现出条带亮度变暗，如图３中的条带ａ、ｂ。第３和第４泳道上出现的条带ｃ则表明在２４０ ｍｇ／ｋｇ和３６０ ｍｇ／ｋｇ浓度下有适应该浓度的细菌，在２４０ ｍｇ／ｋｇ浓度处理４ ｄ时出现的新条带反映的可能是此种细菌，随着土壤中对二氯苯的挥发，原来３６０ ｍｇ／ｋｇ浓度降低至该种细菌能适应的浓度。由处理１８ ｄ时电泳图谱泳道间的遗传簇关系（图４）可见，第２、第３和第４泳道与对照的相似性为７３．４％～７６．５％，较处理初期相比有所提升，而对二氯苯含量６００ ｍｇ／ｋｇ的相似性也从处理初期的６２．７％提高到了６９．４％。造成这种情况的原因可能是随着对二氯苯的在土壤中的降解以及挥发，在土壤中的有效浓度降低，微生物的生长受到的抑制作用减小所引起的。值得注意的是，在土壤处理１８ ｄ时，原来在２４０ ｍｇ／ｋｇ浓度时出现的新条带也在３６０ ｍｇ／ｋｇ时出现了，而对照及其他处理都没有，更加肯定了此种微生物能适应土壤中适宜的对二氯苯浓度。

２．３对二氯苯处理４５ ｄ土壤细菌群落总ＤＮＡ的ＤＧＧＥ分析

对二氯苯处理４５ ｄ时土壤细菌群落ＤＧＧＥ电泳图谱与处理４ ｄ时相比发生了较大的改变，各浓度对二氯苯处理下条带数目有所增加（图５），在土壤培养４５ ｄ时，不同处理土壤样品之间差异开始变小，对二氯苯浓度为１２０ ｍｇ／ｋｇ时谱型与对照的相似性为８４．３％，但亮度稍变暗；对二氯苯浓度为３６０ ｍｇ／ｋｇ时谱型与对照的相似度达到７１．５％。图６中不同处理谱型与对照的相似性都在７０．０％以上，其中１２０ ｍｇ／ｋｇ处理时更是达到８４．３％。表明在土壤培养４５ ｄ时，不同对二氯苯浓度的土壤样品之间的差异开始变小。

３结论

通过对不同处理时间、不同浓度对二氯苯胁迫下湿地土壤的细菌群落总ＤＮＡ进行ＤＧＧＥ多样性分析，结果表明，不同浓度对二氯苯对湿地土壤细菌组成产生了明显影响。不同浓度对二氯苯不仅影响了组成细菌群落的细菌种群数目，还使细菌群落结构以及多样性发生了改变。说明土壤细菌群落中各个种群是相互作用的，各土壤样品细菌群落遗传多样性是对各种群的群体性反映。但是细菌群落遗传多样性并不是简单地随着对二氯苯浓度提高而减小。在较低浓度对二氯苯污染的样点，ＤＧＧＥ图谱条带数目虽然变化不大，但组成图谱的条带亮度不同。说明不同种类的细菌不仅对对二氯苯的敏感性不同，而且对不同程度的对二氯苯污染敏感性也不同。考虑到细菌种群之间诸如偏利、协同、共生、偏害、竞争等复杂的关系，可能是一定程度的对二氯苯污染改变了群落内部种群之间的关系，某些对对二氯苯敏感的细菌的消亡或者一些耐受对二氯苯的细菌产生的抗性保护了其他种群的细菌。细菌群落的耐受性可能是因为后天适应、基因突变或者通过群落结构中种群组成的改变而更具有耐受性。对二氯苯污染土壤微生态环境与细菌多样性的内在关系主要表现在作用与反作用、抑制与适应、稳定与变异、诱导与重建的相互依存、相互影响、共同演化，其结果使得适应对二氯苯胁迫环境的优势菌群得以保留，群落结构和多样性发生变化，耐受性提高。

在研究中，在土壤处理初期含对二氯苯２４０ ｍｇ／ｋｇ的培养土中出现一条新增条带，为对照及其他处理土壤所没有，处理后期随着对二氯苯浓度降低而消失，说明土壤中存在着适应对二氯苯适宜浓度而良好生长的细菌。

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（责任编辑郑威）

收稿日期：２０１１－１０－２４

基金项目：江苏省自然科学基金项目（ＢＫ２００９１７１）；江苏省高校“青蓝工程”基金项目

作者简介：徐文品（1986-），男，甘肃兰州人，在读硕士研究生，研究方向为环境污染治理技术，（电话）１３０９２１７８０８９（电子信箱）ｘｘｘｘ１２１４４＠１２６．ｃｏｍ；

通讯作者，丁成，教授，博士，主要从事环境污染治理技术研究工作，（电话）１３８１５５８８０１１（电子信箱）１３８１５５８８０１１＠163．ｃom。