REMI介导红曲霉遗传转化条件的优化

周礼红 陈平 赵永霞 荆雯雯 李祝 葛永仪

摘要：为了构建限制性内切酶介导的整合（ＲＥＭＩ）技术介导的红曲霉（Ｍｏｎａｓｃｕｓ anka）遗传转化系统，以潮霉素B作为抗性筛选标记，ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ、ｐＣＢ１００３、ｐＡＮ７－１作为转化质粒，采用ＲＥＭＩ技术转化红曲霉。结果表明，用ＲＥＭＩ技术介导红曲霉转化时，质粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ和ｐＣＢ１００３适合于红曲霉的转化。环状质粒与线性质粒的转化率无显著差别；在用ＲＥＭＩ技术介导转化时添加酶切缓冲液不利于转化；原生质体浓度为１×１０７～１×１０８个／ｍＬ时，每微克质粒可获得的潮霉素Ｂ抗性转化子为２ ８００～３ ２００个；ＨｉｎｄⅢ介导转化时的最佳酶用量为１０5～１２０ Ｕ；在质粒用量为８ μｇ／１００ μＬ时转化率最高。

关键词：红曲霉（Ｍｏｎａｓｃｕｓ anka）；遗传转化；限制性内切酶介导的整合（REMI）

中图分类号：Ｑ９３３文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０12）18－4129-05

Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｆｒｏｍ Ｍｏｎａｓｃｕｓ anka ｂｙ Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ Ｅｎｚｙｍｅ－Mｅｄｉａｔｅｄ ＤＮＡ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ （ＲＥＭＩ）

ＺＨＯＵ Ｌｉ－ｈｏｎｇ，ＣＨＥＮ Ｐｉｎｇ，ＺＨＡＯ Ｙｏｎｇ－ｘｉａ，ＪＩＮＧ Ｗｅｎ－ｗｅｎ，ＬＩ Ｚｈｕ，ＧＥ Ｙｏｎｇ－ｙｉ

（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｇｕｉｚｈｏｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｇｕｉｙａｎｇ ５５００２５，Ｃｈｉｎａ）

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｍｏｎａｓｃｕｓ anka ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ（ＲＥＭＩ）， ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｈｐｈ ｇｅｎｅ ａｓ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ ａｎｄ ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ， ｐＣＢ１００３ ａｎｄ ｐＡＮ７－１ ａｓ ｖｅｃｔｏｒ， ｔｈｅ ｆｕｎｇｕｓ Ｍ． ａｎｋａ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ ｔｏ ｂｅ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｂｙ ＲＥＭＩ． Ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅｓ ｔｏ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅｓ ｒｅｓｕｌｔｅｄ ｉｎ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗｈｅｎ ｕｓｉｎｇ ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ ａｎｄ ｐＣＢ１００３ ａｓ ｖｅｃｔｏｒｓ． Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｈａｄ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ ｎｏ ｍａｔｔｅｒ ｉｆ ｖｅｃｔｏｒｓ ｗｅｒｅ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｏｒ ｎｏｔ． Ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ｒｅｓｕｌｔｅｄ ｉｎ ｒｅｄｕｃｉｎｇ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ． Ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｓ ａｔ the ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ １×１０７～１×１０８ ｍＬ ｗｅｒｅ ｆｉｔ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ Ｍ． ａｎｋａ， ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒ ｗａｓ ２ ８００～３ ２００ ｉｎｄ．／μｇ ｖｅｃｔｏｒ ＤＮＡ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ａｎｄ ｖｅｃｔｏｒ ｄｏｓｅ ｗａｓ １０5～１２０ Ｕ ａｎｄ ８ μｇ／１００ μＬ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．

Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｓｐ．； ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ； ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ（ＲＥＭＩ）

限制性内切酶介导的整合（Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ eｎｚｙｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＤＮＡ iｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，ＲＥＭＩ）技术是将ＤＮＡ转化进入真核细胞，并产生非同源整合的一种方法。ＲＥＭＩ的非同源整合机理与非同源末端连接（Ｎｏｎｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｅｎｄ－ｊｏｉｎｉｎｇ，ＮＨＥＪ）相关［１－４］，整合的过程［５］可简单归结为三步：首先在转化过程中使线性化ＤＮＡ的酶随线性化ＤＮＡ进入核内；第二，限制性内切酶在特定识别位点酶切宿主染色体ＤＮＡ；第三，染色体ＤＮＡ和转化片段在体内互补末端连接产生非同源整合事件。

１９９１年Ｓｃｈｉｅｓｔｌ等［６］首次将ＲＥＭＩ技术应用于极易同源整合的Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ。Ｋｕｓｐａ等［７］首先将ＲＥＭＩ技术应用于Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｉｕｍ克隆发育基因，构建了ＲＥＭＩ－ＲＦＬＰ（限制性片段长度多态性）图谱［８，９］，并克隆了很多发育基因，使发育途径的研究变得更加容易。应用该方法已分离到几个植物致病真菌的毒力因子［５］。ＲＥＭＩ技术还成功应用于子囊菌Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ［１０］和玉米致病真菌Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ［１１］、 Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ［１２］的遗传互补分析，以及启动子捕获等。

研究探讨了不同限制性内切酶介导转化红曲霉的能力，以及酶切缓冲液和不同质粒对转化率的影响，同时优化了酶的用量、受体细胞浓度等条件。

１材料与方法

１．１材料

１．１．１菌株、质粒与培养基菌株Ｍ７５７７是野生型红曲霉（Ｍｏｎａｓｃｕｓ ａｎｋａ），由贵州大学真菌资源研究所分离、保存。

用于遗传转化的质粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ由法国Ｓｉｌａｒ教授惠赠，该质粒携带潮霉素Ｂ抗性基因（ｈｐｈ）［１３］，是用限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ酶切线性化的。

质粒ｐＡＮ７－１［１４］带有来自Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ的ｇｐｄ基因的启动子和ｔｒｐＣ基因［１５］的终止子。用ＨｐｈⅠ酶切质粒ｐＡＮ５２－１，用Ｔ４ ＤＮＡ聚合酶补平末端，再用ＢａｍＨⅠ酶切得到１．１ ｋｂ ｈｐｈ基因片段（ｈｐｈ基因缺失了不影响酶功能的前３个密码子）［１６］，与Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ 带有起始密码子ＡＴＧ的ｇｐｄ基因５′端融合；ｈｐｈ基因下游密码子区域与Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ ｔｒｐＣ基因末端区域的ＨｐｈⅠ－ＢａｍＨⅠ片段融合，克隆到质粒ｐＡＮ５２－１（克隆前先用ＮｃｏⅠ酶切ｐＡＮ５２－１，用Ｔ４ ＤＮＡ聚合酶补平末端，再用Ｂａｍ Ｈ Ｉ酶切）上构建得到ｐＡＮ７－１。

质粒ｐＣＢ１００３带有来自ｐＣＳＮ４３［１７］的２．４ ｋｂ ＳａｌⅠ片段（含有潮霉素Ｂ抗性基因ｈｐｈ和来自Ａ． ｎｉｄｕｌａｎｓ的ｔｒｐＣ启动子和终止子），通过单个碱基的改良消除了ｈｐｈ基因中的４个限制性内切酶位点：ＥｃｏＲⅠ（ＧＡＧＴＴＣ）、ＰｓｔⅠ（ＣＴＧＧＡＧ）、ＳｓｔⅡ（ＣＣＧＣＧＣ）和Ｂａｍ ＨＩ （ＧＧＴＴＣＣ），但ｈｐｈ基因编码的氨基酸序列未变。通过ＰＣＲ技术消除ｔｒｐＣ终止子，获得了１．４ ｋｂ的片段，并在片段两端引入ＥｃｏＲⅠ、ＳａｌⅠ和ＨｐａⅠ位点，最后通过ＥｃｏＲⅠ位点亚克隆到ｐＵＣ１９构建得到ｐＣＢ１００３。

菌丝生长的ＣＭ培养基和产孢培养基按文献［１８］配制，原生质体再生液体和固体培养基是分别于ＣＭ液体和琼脂糖固体培养基中加入蔗糖，终浓度为０．６ ｍｏｌ／Ｌ；复苏液体培养基、马铃薯葡萄糖液体培养基中加蔗糖，终浓度为０．６ ｍｏｌ／Ｌ。

１．１．２药品与试剂各种限制性内切酶和ｐｆｕ ＤＮＡ聚合酶为Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ公司产品，Ｃｅｌｌｕｌａｓｅ、Ｌｙｓｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ购于Ｓｉｇｍａ公司，Ｓｎａｉｌａｓｅ购于华美生物工程公司，琼脂糖购于Ｂｉｏｗｅｓｔ公司，质粒中量制备试剂盒为德国Ｑｉａｇｅｎ公司产品，其余试剂均为进口或国产分析纯。

电击转化缓冲液Ⅰ含有１０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、６００ ｍｍｏｌ／Ｌ蔗糖、１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＬｉＡｃ，用于不含聚乙二醇４ ０００的原生质体电击转化；电击转化缓冲液Ⅱ含有１０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、６００ ｍｍｏｌ／Ｌ蔗糖、１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＬｉＡｃ、３００ ｇ／Ｌ聚乙二醇４ ０００，用于含聚乙二醇４ ０００的原生质体电击转化；电击转化缓冲液Ⅲ含有１０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ７．５）、２７０ ｍｍｏｌ／Ｌ蔗糖、１ ｍｍｏｌ／Ｌ ＬｉＡｃ，用于萌发孢子的电击转化。

ＳＴＣ溶液含有１ ｍｏｌ／Ｌ山梨醇、５０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２，ＰＴＣ溶液含有４００ ｇ／Ｌ聚乙二醇４ ０００、５０ ｍｍｏｌ／Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ＣａＣｌ２。

１．２方法

１．２．１原生质体的制备参考文献［19］。菌株Ｍ７５７７在产孢培养基上于３０ ℃培养７～１０ ｄ，收集孢子并制备成均一的浓度为１×１０８～１×１０９ 个／ｍＬ的孢子悬液。取２００ μＬ孢子悬液涂布于铺有玻璃纸的ＰＤＡ平板上，于３０ ℃培养３０ ｈ，收集菌丝体，用１ ｍｏｌ／Ｌ ＭｇＳＯ４溶液洗１次。约３００ ｍｇ菌丝体加３０ ｍＬ裂解酶液，于３０ ℃以６０ ｒ／ｍｉｎ酶解２～３ ｈ，过滤，滤液于４ ℃、以３ ２００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ。弃上清，用１．２ ｍｏｌ／Ｌ预冷的山梨醇溶液洗原生质体沉淀２次，分为２份。一份重悬于１．２ ｍｏｌ／Ｌ预冷的山梨醇溶液中，一份用预冷的ＳＴＣ溶液洗１次。两份样品均置于冰浴备用。

１．２．２质粒的线性化用ＨｉｎｄⅢ酶切线性化质粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ。酶切反应体系：３６ μＬ １０×Ｅｎｚｙｍｅ Ｂｕｆｆｅｒ，２０ μｇ ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ，１２ μＬ １０ Ｕ／μＬ ＨｉｎｄⅢ，加ｄｄＨ２Ｏ至３６０ μＬ，置于３７ ℃水浴２～４ ｈ，于６５ ℃水浴反应１５ ｍｉｎ，停止反应，然后分为２份，一份备用，称为质粒Ａ液；另一份用苯酚－氯仿抽提纯化，然后溶解于无菌去离子水，称为质粒Ｂ液。

１．２．３ＲＥＭＩ技术的转化方法参考文献［20］。用预冷的ＳＴＣ溶液洗原生质体并再重悬，浓度调整至５×１０７个／ｍＬ。取１００ μＬ转化用原生质体液，加入１ μｇ环状质粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ，轻轻吹吸混匀；分别加限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ ３０～１９０ Ｕ，冰浴３０ ｍｉｎ，加１ ｍＬ ＰＴＣ，于室温静置４０～６０ ｍｉｎ，涂布于含有１２０ μｇ／ｍＬ潮霉素Ｂ的再生琼脂糖固体培养基平板上，每个平板涂布２００ μＬ转化液。于３０ ℃暗培养４～５ ｄ，统计转化子数。

１．２．４最适质粒的选择采用３个启动子序列来源不同的环状质粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ、ｐＣＢ１００３、ｐＡＮ７－１，用量为７５或１０５ Ｕ的限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ、ＳａｃⅠ、ＢａｍＨⅠ，将１ μｇ不同质粒和限制性内切酶分别加到１００ μＬ ５×１０７个／ｍＬ原生质体中，对红曲霉进行转化试验，以潮霉素B抗性转化子数为指标评价和筛选适合转化红曲霉的质粒。

１．２．５最适限制性内切酶的选择选择７种不同的限制性内切酶为转化质粒，其中平末端酶有ＳｍａⅠ和ＨｐａⅠ，５′端突出末端酶有ＨｉｎｄⅢ、ＳａｌⅠ和ＥｃｏＲⅠ，３′端突出末端酶有ＫｐｎⅠ、ＳａｃⅠ，向１００ μＬ ５×１０６个／ｍＬ原生质体液中加入１ μｇ线性或环状质粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ和７５ Ｕ限制性内切酶进行转化试验，以不加酶处理的作对照，以潮霉素B抗性转化子数为指标评价和筛选合适的限制性内切酶。

１．２．６酶切缓冲液对转化的影响试验有７种试验方案，１００ μＬ原生质体液中，①加质粒Ａ液和１０５ Ｕ ＨｉｎｄⅢ，②加质粒Ｂ液、１０５ Ｕ ＨｉｎｄⅢ和10×酶切缓冲液，③加质粒Ｂ液和１０５ Ｕ ＨｉｎｄⅢ，④加环状质粒、１０５ Ｕ ＨｉｎｄⅢ和10×酶切缓冲液，⑤加环状质粒和１０５ Ｕ ＨｉｎｄⅢ，⑥加质粒Ｂ液，⑦加环状质粒作为对照。然后轻轻吹吸混匀，冰浴３０ ｍｉｎ，加１ ｍＬ ＰＴＣ溶液，于室温静置４０～６０ ｍｉｎ。取转化液涂布于含有１２０ μｇ／ｍＬ潮霉素Ｂ的再生琼脂糖固体培养基平板上，每个平板涂布２００ μＬ，于３０ ℃暗培养４～５ ｄ，统计潮霉素B抗性转化子数。

１．２．７最适原生质体浓度的选择将８ μｇ质粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ和１０５ Ｕ限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ分别加入１００ μＬ浓度分别为１．０×１０６、５．０×１０６、１．０×１０７、５．０×１０７、１．０×１０８、１．５×１０８个／ｍＬ原生质体中进行转化试验。以潮霉素B抗性转化子数为指标确定适合转化的红曲霉原生质体浓度。

１．２．８最适ＨｉｎｄⅢ用量的选择在１００ μＬ含有８ μｇ环状质粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ的５×１０７个／ｍＬ原生质体中分别加入0、３０、４５、６０、７５、９０、１０５、１２０、１３５、１５０、１９０ Ｕ ＨｉｎｄⅢ进行转化试验。以潮霉素B抗性转化子数为指标确定最适合转化的ＨｉｎｄⅢ用量。

１．２．９最适质粒用量的选择在１００ μＬ含有１００ Ｕ ＨｉｎｄⅢ的５×１０７个／ｍＬ原生质体中分别加入１、２、４、８、１６ μｇ质粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ进行转化试验。以潮霉素B抗性转化子数为指标确定最适合红曲霉转化的质粒用量。

２结果与分析

２．１最适质粒的选择结果

为了探讨不同构建方法得到的质粒对红曲霉转化的影响，试验中用了３个启动子序列来源不同的质粒进行转化（质粒均未线性化），试验中环状质粒用量为１ μｇ，原生质体浓度为５×１０７个／ｍＬ。由表１可知，质粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ对红曲霉的转化率非常高，转化子达（２ ６７９±８）个／μｇ；ｐＣＢ１００３次之；ｐＡＮ７－１的转化率最差，仅为15～４1个／μｇ。由此可知，质粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ和ｐＣＢ１００３适合于红曲霉的转化，而ｐＡＮ７－１用于红曲霉的转化不理想。因此后续试验所用质粒均为ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ。

２．２最适限制性内切酶的选择结果

应用ＲＥＭＩ技术建立遗传转化系统时，限制性内切酶种类的选择至关重要。为了选择合适的限制性内切酶，首先选择７种不同的限制性内切酶（包括５′端突出末端酶、３′端突出末端酶及平末端酶），以ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ为转化质粒，转化红曲霉并确定转化能力。

向１００ μＬ ５×１０６个／ｍＬ原生质体液中加入１ μｇ线性或环状质粒和７５ Ｕ限制性内切酶进行转化试验。由图１可知，３种不同末端酶都能较好地介导质粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ转化进入红曲霉，潮霉素B抗性转化子数都较未加限制性内切酶的对照提高了３倍以上，但提高幅度却因酶种类的不同而存在较大差异。对于环状质粒，５′端突出末端酶（ＨｉｎｄⅢ和ＳａｌⅠ）的作用效果优于平末端酶（ＨｐａⅠ和ＳｍａⅠ）和３′端突出末端酶（ＫｐｎⅠ）。其中，ＨｉｎｄⅢ和ＳａｌⅠ对转化能力的提高和改善最有效，每微克质粒ＤＮＡ的转化子数约是对照的１５倍。并且稳定性检测表明约有７０％的转化子稳定。

由图１还可知，具有同种类型末端的限制性内切酶介导ＤＮＡ转化红曲霉的能力也存在很大差异。如平末端酶ＳｍａⅠ就优于ＨｐａⅠ，ＨｉｎｄⅢ、ＳａｌⅠ优于ＥｃｏＲⅠ。此外，选用的限制性内切酶即使在被转化的ＤＮＡ上不存在酶切位点，也仍能较好地介导ＤＮＡ转化红曲霉，如ＥｃｏＲⅠ。

因此，限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ和ＳａｌⅠ有利于转化。

２．３酶切缓冲液对转化红曲霉的影响

限制性内切酶在特定的环境条件和反应体系里才能很好地发挥功能。为了探讨酶切缓冲液是否会影响限制性内切酶介导ＤＮＡ的转化，选用了ＨｉｎｄⅢ来进行试验，原生质体浓度为５×１０６个／ｍＬ。由表２可知，无论是线性质粒还是环状质粒，在由限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ介导转化红曲霉时，添加酶切缓冲液导致转化率降低，以环状质粒介导转化ＤＮＡ时，转化率下降尤为显著。在限制性内切酶介导转化时添加酶切缓冲液，不仅没有促进转化率的提高，反而降低了转化能力。其原因可能是加入酶切缓冲液后，离子浓度增大，离子种类也增多，改变了转化反应环境，从而影响到红曲霉细胞膜的通透性。

从图１和表２可知，质粒是否线性化对红曲霉的转化效果（包括转化子数和转化子稳定性）影响不显著（Ｐ＞０．０５），为了简便和节约，后续试验用环状质粒进行转化更为合适。

２．４最适原生质体浓度的选择结果

无论是真核生物还是原核生物，转化时受体细胞（或者感受态细胞）的浓度是影响转化率的一个重要因素。因此，用质粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ和１０５ Ｕ限制性内切酶ＨｉｎｄⅢ探讨了原生质体浓度对于转化红曲霉的影响。由图２可知，原生质体浓度为１×１０７～１×１０８个／ｍＬ时，每微克质粒ＤＮＡ可获得的潮霉素Ｂ抗性转化子为２ ８００～３ ３００个。当原生质体浓度低于１×１０７个／ｍＬ和高于１×１０８个／ｍＬ时，转化子数开始大幅下降，表明原生质体浓度过低和过高都会不利于外源ＤＮＡ进入受体细胞内。

因此，原生质体浓度为１×１０７～１×１０８个／ｍＬ时最有利于转化。

２．５最适ＨｉｎｄⅢ用量的选择结果

ＲＥＭＩ介导转化时，限制性内切酶的浓度是需要优化的重要条件之一，是影响转化效率的关键因素。在１００ μＬ含有环状质粒的５×１０７个／ｍＬ原生质体中分别加入不同浓度的ＨｉｎｄⅢ，结果如图３，当ＨｉｎｄⅢ用量为０～７５ Ｕ时，随着ＨｉｎｄⅢ用量的增加潮霉素Ｂ抗性转化子数缓慢增多；当ＨｉｎｄⅢ用量超过７５ Ｕ时，转化子数陡然上升，至１０５ Ｕ时达到最大。然后，随着ＨｉｎｄⅢ用量继续增大，转化子数则开始减少，且差异显著（Ｐ＜０．０５）。因而，ＨｉｎｄⅢ用量为１０5～１２０ Ｕ时最有利于转化。

２．６最适质粒用量的选择结果

１００ μＬ反应体系中加１、２ μｇ质粒时的转化子数很少；当增到４ μｇ时转化子数陡然增加，较１ μｇ时提高了１倍多；加到８ μｇ时，转化子数较４ μｇ时显著增多（Ｐ＜０．０５），有约３ ２００个／μｇ。再增加至１６ μｇ时转化率又大幅下降（图４）。表明质粒用量对转化率有很大影响，最佳质粒用量约为８ μｇ／１００ μＬ。

３小结与讨论

采用ＲＥＭＩ技术介导转化时，质粒ｐＢＣ－Ｈｙｇｒｏ和ｐＣＢ１００３适合于红曲霉的转化。质粒是否线性化对转化率影响不大，但添加酶切缓冲液不利于转化；原生质体浓度为１×１０７～１×１０８个／ｍＬ时最有利于转化，ＨｉｎｄⅢ介导红曲霉转化时的最佳酶用量为１０5～１２０ Ｕ，质粒用量为８ μｇ／１００ μＬ时转化率最高。

ＲＥＭＩ技术首次报道的是用于Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ的非同源ＤＮＡ转化［６］，Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ是第一个成功应用ＲＥＭＩ作为遗传工具的丝状真菌［１２］，随后屡有报道。该技术不仅用于提高转化率，还应用于其他的遗传分析如基因和启动子捕获，遗传互补分析等。

转化反应体系中，外源ＤＮＡ和受体细胞（原生质体）的浓度之所以影响转化子的数量，很大程度上可能是因为它们影响了外源ＤＮＡ进入细胞的能力，其原因可能是，原生质体细胞之间的碰撞频率以及外源ＤＮＡ与受体细胞之间的碰撞频率都会因反应体系中细胞和外源ＤＮＡ的浓度而发生变化，从而影响外源ＤＮＡ与受体细胞膜表面的接触机率；在小生态中，细胞个体之间存在信号物质的传递，以此来调控细胞内外环境的平衡以及群落个体之间的平衡，由此来维持群落的生命，因此，反应体系中原生质体浓度会影响到细胞间的信号传递，从而调整细胞膜对胞外物质的识别、结合与输送等；此外，外源ＤＮＡ在反应体系中的浓度也会影响到受体细胞信号物质的分泌及其在细胞间的传递，进而影响到细胞对特定胞外物质的摄入量。

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［７］ ＫＵＳＰＡ Ａ，ＬＯＯＭＩＳ Ｗ Ｆ． Ｔａｇｇｉｎｇ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ［Ｊ］． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９２，８９（１８）：８８０３－８８０７．

［８］ ＫＵＳＰＡ Ａ，ＬＯＯＭＩＳ Ｗ Ｆ． ＲＥＭＩ－ＲＦＬＰ ｍａｐｐｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｇｅｎｏｍｅ［Ｊ］． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９４，１３８（３）：６６５-６７４．

［９］ ＬＯＯＭＩＳ Ｗ Ｆ，ＷＥＬＫＥＲ Ｄ，ＨＵＧＨＥＳ Ｊ，ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｍａｐｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ ｉｎ Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ［Ｊ］． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９５，１４１（１）：１４７－１５７．

［１０］ ＬＵ Ｓ，ＬＹＮＧＨＯＬＭ Ｌ，ＹＡＮＧ Ｇ，ｅｔ ａｌ． Ｔａｇｇｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ａｔ ｔｈｅ Ｔｏｘ１ ｌｏｃｕｓ ｏｆ Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ ｈｅｔｅｒｏｓｔｒｏｐｈｕｓ ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ，１９９４，９１（２６）：１２６４９－１２６５３．

［１１］ ＢＯＬＫＥＲ Ｍ，ＢＯＨＮＥＲＴ Ｈ Ｕ，ＢＲＡＵＮ Ｋ Ｈ，ｅｔ ａｌ． Ｔａｇｇｉｎｇ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ（ＲＥＭＩ）［Ｊ］． Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，１９９５，２４８（５）：５４７－５５２．

［１２］ ＳＡＮＣＨＥＺ Ｏ，ＮＡＶＡＲＲＯ Ｒ Ｅ，ＡＧＵＩＲＲＥ Ｊ． Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ａｎｄ ｔａｇｇｉｎｇ ｏｆ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ （ＲＥＭＩ）［Ｊ］． Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，１９９８，２５８（１）：８９－９４．

［１３］ ＳＩＬＡＲ Ｐ． Ｔｗｏ ｎｅｗ ｅａｓｙ ｔｏ ｕｓｅ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ［ＥＢ／ＯＬ］． ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｇｓｃ．ｎｅｔ／ｆｇｎ４２／ｓｉｌａｒ．ｈｔｍｌ，２０１０－０７－１３．

［１４］ ＰＵＮＴ Ｐ Ｊ，ＯＬＩＶＥＲ Ｒ Ｐ，ＤＩＮＧＥＭＡＮＳＥ Ｍ Ａ，ｅｔ ａｌ． Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｍａｒｋｅｒ ｆｒｏｍ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ［Ｊ］． Ｇｅｎｅ，１９８７，５６（１）：１１７－１２４．

［１５］ ＭＵＬＬＡＮＥＹ Ｅ Ｊ，ＨＡＭＥＲ Ｊ Ｅ，ＲＯＢＥＲＴＩ Ｋ Ａ，ｅｔ ａｌ． Ｐｒｉｍａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｒｐＣ ｇｅｎｅ ｆｒｏｍ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ［Ｊ］． Ｍｏｌ Ｇｅｎ Ｇｅｎｅｔ，１９８５，１９９（１）：３７－４５．

［１６］ ＫＡＳＴＥＲ Ｋ Ｒ，ＢＵＲＧＥＴＴ Ｓ Ｇ，ＩＮＧＯＬＩＡ Ｔ Ｄ． Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｓ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ ｉｎ ｙｅａｓｔ［Ｊ］． Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ，１９８４，８（５）：３５３－３５８．

［１７］ ＳＴＡＢＥＮ Ｃ，ＪＥＮＳＥＮ Ｂ，ＳＩＮＧＥＲ Ｍ，ｅｔ ａｌ． Ｕｓｅ ｏｆ ａ ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ Ｂ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｇｅｎｅ ａｓ ａ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｓｅｌｅｃｔａｂｌｅ ｍａｒｋｅｒ ｉｎ Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ ｃｒａｓｓａ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ［Ｊ］． Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｎｅｗｓｌ，１９８９，３６（４）：７９－８１．

［１８］ ＬＡＫＲＯＤ Ｋ，ＣＨＡＩＳＲＩＳＯＯＫ Ｃ，ＳＫＩＮＮＥＲ Ｄ Ｚ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｇｅｎｅｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｌｂｉｎｏ Ｍｏｎａｓｃｕｓ ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ［Ｊ］． Ｊ Ｉｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００３，３０（６）：３６９－３７４．

［１９］ 周礼红，李国琴，王正祥，等． 红曲霉原生质体的制备、再生及其遗传转化系统［Ｊ］．遗传，２００５，２７（３）：４２３－４２８．

［２０］ 周礼红，诸葛健，王正祥． 红曲霉不同转化方法的比较［Ｊ］．遗传，２００６，２８（４）：４７９－４８５．

收稿日期：２０１２－０４－２８

基金项目：贵州省科技厅农业攻关项目（黔科合ＮＹ字［２００８］３０５８）；贵州大学研究生创新基金项目（校研农２０１０００３）

作者简介：周礼红（１９７５－），女，贵州清镇人，副教授，博士，主要从事发酵工程、真菌遗传与育种研究工作，（电话）０８５１－３８５１１５８（电子信箱）

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