激素法与液氮法在兔股骨头坏死造模中的应用比较研究

王萧枫 吴银生 王利明(等）

[摘要] 目的 分析比较激素法与液氮法在股骨头坏死动物模型的应用。 方法 30只兔随机分为3组，A组为单纯激素注射组，兔子每周2次臀肌注射醋酸泼尼松龙，每次8 mg/kg，连续6周；B组为用液氮将股骨头冷冻坏死；C组为空白对照组。对一般形态学、影像学MRI、组织病理学等进行观测。 结果 A、B两组股骨头均出现缺血性坏死表现，空骨陷窝率较对照组明显增高（P < 0.01），并且3周时A组空骨陷窝率明显低于B组（P < 0.01），6周时A组与B组空骨陷窝率无明显差异（P > 0.05）。A组兔全身药物反应明显，骨坏死修复晚且能力差，且骨陷窝空虚率随时间延长而增加（P < 0.01）。B组兔造模所需时间短，骨修复反应大，随着实验观察时间延长，骨坏死程度是进行性减轻（P < 0.01）。 结论 通过单纯激素或液氮冷冻股骨头均可建立兔非创伤性缺血性坏死动物模型， 前者较适合于病因、病理方面或者综合性研究；后者更适合于标准化治疗的研究。

[关键词] 股骨头坏死；激素；液氮；疾病模型

[中图分类号] R681.8[文献标识码] A[文章编号] 1673—9701（2012）25—0018—03

The comparative application of hormonal method and liquid nitrogen method in modeling of femoral head necrosis in rabbits

WANG Xiaofeng1 WU Yinsheng1 WANG Liming2 MAO Qiang2 JIN Hongting2

1.Department of Orthopedics， Hospital of the Integration of Traditional Chinese and Western Medicine， Wenzhou 325000， China； 2.Fractures Research Institute， Zhejiang Chinese Medical University， Hangzhou 310053， China

[Abstract] Objective To compare hormonal methods and liquid nitrogen method of vascular necrosis of the femoral head （ANFH）. Methods All 30 rabbits were randomly divided into three groups， Group A was taken simple hormone injection， prednisolone acetate 8 mg/kg i.m twice a week was administrated for 6 weeks；Group B was established by improved liquid nitrogen frozen method；Group C was the control group. The general morphology， imaging MRI， histopathology and other were observed. Results A， B groups were successful modeling， the rate of empty lacunae in the hormone， A and B groups were obviously increased more than that of control group at 3 weeks or 6 weeks after model preparation（P < 0.01）， group A of empty lacunae was significantly lower than that of group B at 3 weeks （P < 0.01）， and there was no significant difference at 6 weeks（P > 0.05）. Compared with group B， rabbits of A group were more systemic drug reactions， bone necrosis later and poor repair， and the rate of empty lacunae lacunae increased with time prolonged （P < 0.01）， and the osteonecrosis degree of group B was progressively alleviate with the experimental observation time （P < 0.01）. Conclusion The model of ANFH disease can be built up by steroid and serum injection or liquid nitrogen in rabbits. The former is more suitable for the cause， pathology， or a comprehensive study；the latter is more suitable for standardized therapy.

[Key words] Femur head necrosis；Steroids；Liquid nitrogen；Disease models

非创伤性股骨头坏死（nontraumatic osteonecrosis of femoral head，NONFH）的发病率近年来正在逐渐增加，其病理过程复杂，病因及发病机理尚未完全明了，治疗方法也多种多样，治疗方法的选择及其疗效还存在很大争议[1]。建立理想的NONFH动物模型，是研究其病因及发病机制十分重要的手段，也是进行治疗研究的基础。激素法与液氮法均是NONFH模型中最常见的方法之一，但二者的致骨坏死机制显然不同，本研究旨在观察两种造模法后动物生存状态及病理改变，为建立NONFH模型研究中提供更理想的方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选用健康成年新西兰大白兔30只，雌雄各半，体重（2.5±0.3） kg。由浙江中医药大学动物实验中心提供[合格证号： SYXK（浙）2008—0116]。饲养条件相同，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。随机分成三组： A组（激素组，n = 10）、B组（液氮冷冻组，n = 10）、C组（空白对照组，n = 10）；动物适应1 周后开始实验。

1.2 方法

A组参照国内贺氏造模法[2]，对造模兔子每周2次臀肌注射醋酸泼尼松龙，每次8 mg/kg，连续6周，同时每周2次肌肉注射青霉素钠4万U/和雷尼替丁针25 mg以预防感染与消化道溃疡。B组参照改良Takaoka造模法[3]，采用30 mg/kg戊巴比妥钠耳静脉麻醉，严格按照无菌操作原则进行手术，取左髋关节外侧切口，分离软组织，切开关节囊，不剪断圆韧带与股骨头脱位，用漏斗将股骨头颈套住，纱布保护周围组织，将液氮20 mL倒入漏斗内，冰冻3 min，50℃温盐水复温，多方位重复3次，逐层缝合切口，术后青霉素4万U肌肉注射（肌注），2次/周。C组为空白对照组，对CA组5只兔每周2次臀肌注射生理盐水5 mL，其他处置与A组相同；对CB组5只兔除了未用液氮冷冻外，其他处置均与B组相同。

1.3 观察指标

①一般形态学观察每周称体重1次，观察并记录动物毛发光泽度、食量、大小便、活动度、步态精神状况等变化；②影像学观察于造模第3、6周末行双侧股骨头MRI摄片，观察有无软骨及软骨下骨质信号改变。③组织病理学观察于造模第3、6周末，各组分别处死一半兔子，并取材股骨头，观察外观、质地，关节软骨色泽、外形等。病理切片HE染色，光镜观察骨组织、骨髓组织变化、骨组织内血管内皮细胞的变化等。光学显微镜10×40倍视野下随机选取10个高倍镜视野，数出总骨陷窝和空骨陷窝数，空骨陷窝率=平均空骨陷窝数/平均总骨陷窝数。

1.4 统计学处理

采用SPSS 13.0统计学软件包进行分析。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用配对t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般形态学观察

在试验期内，A组兔从第2周开始出现精神萎靡懒动，毛色渐失光泽，第3周出现毛发蓬松易脱落、少食、消瘦、皮下脂肪显著减少，并呈逐渐加重趋势，有些兔子出现腹泻；到第5周时可观察到大部分兔出现站立困难，跛行等现象。至6周末A组体重平均较造模前下降了31.26%；幸存的兔子精神状态及体重趋于稳定。B组兔术后切口均一期愈合，大部分伤口缝线自行脱落，无发生髋关节脱位、腹泻等现象，第1周时有左髋部畏动，进食量偏少，第3周时可见左髋活动减少，但全身情况良好，无毛色失光、易脱落、消瘦等现象，至第6周基本恢复正常，体重无明显变化。C组所有兔体重保持稳定，甚至稍微增加，精神良好，机灵活泼。

2.2 影像学观察

实验3、6周时所有实验动物蛙式正位X片示双侧股骨头均无明显变化，A组3周时MRI检查有6个股骨头（4只）关节面下有透亮区或密度增高，表现为坏死区在T1WI上为中低信号，在T2WI上呈较高信号，周围环绕线样低信号，6周时有14个股骨头（8只） 现关节囊内有条状水样信号，双侧股骨头信号不均匀，新月状透亮影，关节间隙变窄，周围软组织略有肿胀（图1）；B组3周时MRI检查有10个股骨头（10只）关节面下表现为股骨头脂肪高信号中出现不同形态的低信号区，呈环形、带状和灶状，6周时9个股骨头（9只）关节面下有透亮区（图2）；C组所有股骨头无明显变化。

2.3 组织病理学观察

A组：股骨头坏死随时间的推移而加重，第3周时的大部分兔股骨头表面色泽较灰暗，并有关节软骨变薄及部分剥脱，骨质松脆；第6周时易于剖开切凿，剖断面有油腻样变，提示有骨质疏松，脂肪变性。切片HE染色：软骨下骨部分变薄，松质骨区出现典型骨坏死灶，骨小梁稀疏萎缩，甚至有断裂现象；骨内小血管病变，有血栓形成；骨髓细胞溶解坏死，碎屑聚集、基质溶解，造血组织及红骨髓明显减少；髓腔内大量脂肪细胞聚集，数量增多、直径增大，部分融合成泡状；骨小梁周沿隐约可见梭形成骨细胞，但数量很少；骨细胞核固缩、崩解，空骨陷窝多见且密集，有骨组织弱修复反应（图3）。

B组：股骨头坏死随时间推移而骨修复反应明显，第3周时所有股骨头的软骨出现剥脱，软骨下骨暴露，骨质硬化，关节软骨下有较多破骨细胞聚集，骨小梁变细，出现折痕或吸收现象；第6周时骨陷窝空虚减少，骨小梁附加骨和新生类骨质较多（图4）。

C组：股骨头骨质坚硬光滑，不易剖开切凿。光镜下股骨头软骨下骨小梁完整，排列规则整齐，骨细胞清晰可见，核位于中央，且较大。成骨细胞沿骨小梁成串分布，有散在的空骨陷窝。骨髓造血细胞丰富，脂肪细胞相对较少。

2.4 造模3、6周时各组的骨陷窝率比较

A、B两组造模3、6周时的骨陷窝率与C组比较，差异分别有统计学意义（△P < 0.05、△△P < 0.01，*P < 0.01、**P < 0.01）；A组造模3周时的骨陷窝率与B组比较，差异有统计学意义（P < 0.01），而造模6周时，两组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

表1 造模3、6周时各组的骨陷窝率比较（x±s）

3 讨论

通过动物模型复制人类疾病是医学科学研究的重要途径之一， 在探讨疾病的病因、 发病机制及防治方法的选择与改进方面均具有重要作用。近30年来，国内外学者对NONFH动物模型的建立进行了许多研究，遗憾的是，到目前为止仍难于模拟出人NONFH的自然病理过程和人NONFH软骨下骨塌陷的临床特征[4]。创伤性股骨头缺血性坏死的发病机制已经明确，而非创伤性股骨头缺血性坏死的发病机制尚未完全明了，但所有股骨头缺血性坏死的病理变化是一致的，即骨细胞坏死和随后的修复反应[5]。目前国内外报道股骨头坏死动物模型的建立方法有很多，最常应用的是激素法诱导或液氮冷冻制作股骨头坏死动物模型。激素法包括单纯激素模型、血清加激素模型、内毒素加激素模型，液氮法包括液氮冷冻与液氮注射法等。

采用单纯激素模型和液氮冷冻模型进行比较分析，发现单纯醋酸泼尼松龙肌注可以成功诱导兔激素性股骨头坏死动物模型，并通过行预防性抗生素与制酸剂的应用，可以减少动物死亡率。而改良Takaoka法建立了液氮冷冻股骨头坏死，操作中不剪断圆韧带，不脱位股骨头，通过各种角度旋转来显露股骨头不同的负重面，进行反复交替液氮冷冻、复温，避免复位后无法有效维持复位状态，一方面影响动物活动，另一方面也难证实是液氮冷冻导致股骨头坏死还是脱位创伤造成股骨头坏死。两者的骨坏死模型均获得MRI与组织病理学的证实。

但两者模型在诸多方面有所不同，在全身情况方面，A组兔模会出现全身库欣氏综合征即皮质醇增多症的表现，如精神萎靡，毛色及皮肤失去正常光泽，肌肉萎缩，机体免疫力下降，易感染。出现股骨头坏死后可表现下肢运动明显受限，站立困难，跛行。A组中从第3周起陆续出现上述的一般表现，6周后大部出现运动明显受限，站立困难，跛行等现象；B组兔模生存状况良好，无生理扰乱现象。在影像学观察方面，A组兔模在3周时仅6个股骨头（4只）、6周时有14个股骨头（8只） 出现MRI信号不均匀，新月状透亮影，关节间隙变窄，周围软组织略有肿胀等炎症水肿表现；B组3周时MRI检查有9个股骨头（9只）关节面下有透亮区，6周时有10个股骨头（10只）关节面下表现为股骨头脂肪高信号中出现不同形态的低信号区，呈环形、带状和灶状。在骨坏死方面，A组兔模出现骨坏死较晚，虽存在个体耐受差异性现象，但随着实验时间延长呈现进行性加重。且多为广泛坏死，其修复晚且能力差[6]，提示病因复杂、综合性的骨坏死，骨修复反应微小。B组兔模出现骨坏死较早，通过液氮冷冻直接使股骨头内的骨细胞坏死并使血管形成血栓进一步阻断股骨头内的血循环，可以造成所有实验股骨头坏死，同时随后的骨修复反应大，随着实验观察时间延长骨坏死程度是进行性减轻。实验的可控性较好[7]。

因此，我们认为在骨坏死模型研究中，激素法与液氮法应该根据实验的实际需要加以选择。由于激素法造成的骨坏死发病机制复杂，有脂质代谢紊乱、血管内凝血、骨内高压、血管损伤、血液黏度增高、骨质疏松等病理改变，是全身综合征下的局部股骨头坏死，较适合于病因、病理方面或者综合性研究；液氮冷冻不同于化学方法造成的坏死， 对动物全身无毒副作用，造模所需时间短，模型坏死成功率高，可重复性强，可作为模拟临床手术清除死骨、植骨治疗研究的动物模型，较其他方法制备的模型更适合于标准化治疗的研究。

[参考文献]

[1]Lieberman JR，Berry DJ，Mont MA，et al. Osteonecrosis of the hip management in the twenty—first—century[J]. J Bone Joint Surg（Am），2002，84（5）：834—853.

[2]贺西京，毛履真，王坤正，等. 肾上腺糖皮质激素引起股骨头缺血性坏死的机制实验研究[J]. 中华骨科杂志，1992，12（6）：440—443.

[3]Takaoka T，Yoshioka T，Hosoya T，et al. The repair process in experimentally induced avascular necrosis of the femoral head in dogs[J]. Arch Orthop Trauma Surg，1981，99（2）：109—115.

[4]林诗富，林娜，陈卫衡，等. 股骨头坏死动物模型研究进展[J]. 贵阳中医学院学报，2006，28（5）：18—21.

[5]Hungerford DS，Lennox DW. Ischemic necrosis of the femoral head Insurgery of the musculoskeletal system[M]. New York：Churchill Livingstone，1990：2757—2794.

[6]李子荣，张念柞，岳德波，等. 激素性股骨头坏死动物模型的诱导和观察[J]. 中华外科杂志，1995，33（8）：485—487.

[7]崔西龙，李章华，戴双武，等. 改良型非创伤性股骨头缺血坏死动物模型的建立[J]. 武汉大学学报（医学版），2010，31（1）：61—64.

（收稿日期：2012—03—22）