小鼠PMX—IRES—Wnt5a逆转录病毒载体的构建及在3T3细胞中的表达

严春 刘彩霞 闫绍荣(等）

[摘要] 目的 构建小鼠Wnt—5a逆转录病毒载体，观察Wnt—5a在3T3细胞的表达情况。 方法 采用同源重组技术将小鼠Wnt—5a插入逆转录病毒载体PMX—IRES—GFP，构建PMX—IRES—Wnt5a重组质粒，利用脂质体转染3T3细胞，RT—PCR检测Wnt—5a mRNA表达情况，Western—Bloting检测Wnt—5a蛋白表达情况。 结果 经限制性内切酶证实成功构建了携带Wnt—5a基因的逆转录病毒载体PMX—IRES—Wnt5a，RT—PCR检测结果显示Wnt—5a在转染的3T3细胞的表达明显增高。 结论 成功构建Wnt—5a逆转录病毒载体，并能在3T3细胞成功表达Wnt—5a。

[关键词] Wnt—5a；逆转录病毒载体

[中图分类号] R782[文献标识码] A[文章编号] 1673—9701（2012）25—0007—02

Construction of mouse PMX—IRES—Wnt5a retroviral expression vector and expression of Wnt—5a in NIH3T3 cells

YAN Chun1 LIU Caixia2 YAN Shaorong1 LI Qiang1 LIN Sen1 WU Wenbing1 WU Lifeng1 CHEN Jiong3

1. Department of Clinical Laboratory，the Peoples Hospital of Ruian City in Zhejiang Province，Ruian 325200，China；

2. Department of Clinical Laboratory，the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College，Wenzhou 325027，China；3. Department of Burn，the Peoples Hospital of Ruian City in Zhejiang Province，Ruian 325200，China

[Abstract] Objective To construct the retroviral expression vector of PMX—IRES—Wnt5a，transfect into 3T3 cells，and observe the expression of Wnt—5a. Methods Gene recombinant technology was employed to clone mouse Wnt—5a gene to the retroviral expression vector of PMX—IRES—GFP， to obtain the recombined plasmid PMX—IRES—Wnt5a，transfect into 3T3 cells by Lipofectamine 2000. The result of transfection was analyzed by RT—PCR and Western—Blotting. Results Identification by enzyme digestion confirmed successful construction of the retroviral expression vector of PMX—IRES—Wnt5a . RT—PCR revealed that the expression of Wnt—5a mRNA and protein was obviously increased in 3T3 cells after transfection. Conclusion The retroviral expression vector of PMX—IRES—Wnt5ais successfully constructed and stably expressed in 3T3 cells.

[Key words] Wnt—5a； Retroviral expression vector

Wnt信号具有多种生物学功能，广泛存在于各种不同物种的生物发育及疾病发生过程中。Wnt途径也参与了外胚层组织器官的生物学过程，具有调控皮肤及其附属器的发育，诱导皮肤干细胞向皮肤附件的形态发生，调节毛囊的周期生长，促进创面修复等功能。因此，通过病毒转染皮肤干细胞，以无细胞真皮替代物为载体诱导皮肤干细胞高表达Wnt信号从而促进皮肤干细胞迁移至受损皮肤并定向分化、增殖形成毛囊，有可能成为解决皮肤功能性重建的新途径。本研究成功构建了小鼠PMX—IRES—Wnt5a逆转录病毒载体并在3T3细胞中获得稳定表达，为研究Wnt信号通路在皮肤功能性重建中的功能、作用机制等奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

PMX—IRES—GFP逆转录病毒载体（Clontech，USA）；限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ、T4 DNA连接酶（BioLabs，NEW ENGLAND）；RNeasy Mini试剂盒、OneStep RT—PCR试剂盒（Qiagen，Germany），胶回收试剂Agarose Gel DNA Purification Kit Ver 2.0（大连宝生物工程有限公司）；转染试剂Lipofectamine 2000 （Invitrogen，USA）；感受态细菌DH5α（Invitrogen，USA），高糖DMEM培养基（Gibco公司），胰蛋白酶（Invitrogen，USA）；所有引物合成及测序由上海生工完成。

1.2 PMX—IRES—Wnt5a逆转录病毒载体的构建与鉴定方法

1.2.1 引物设计及合成根据GenBank上鼠Wnt—5a的mRNA功能全长序列，采用Primer 5.0设计一对引物，并导入BamHⅠ和HindⅢ酶切位点，其引物序列如下：Sense： 5'—CCC A↑AGCTT GGCATCAAGGAATGCCAGTA—3' （HindⅢ）；Antisense：5'— CGC G↑GATCC GTACGTGAAGGCCGTCTCTC—3' （BamHⅠ）。

1.2.2 目的基因获取RNeasy Mini试剂盒提取小鼠总RNA，采用OneStep RT—PCR试剂盒进行PCR扩增获得Wnt—5a基因产物，凝胶电泳后采用胶回收试剂Agarose Gel DNA Purification Kit Ver2.0进行回收纯化，纯化产物进行测序鉴定。

1.2.3 重组逆转录病毒载体将PMX—IRES—GFP逆转录病毒载体经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后，在T4 DNA连接酶作用下，与上述PCR纯化产物于4 ℃条件下12 h连接反应，将连接产物转化到DH5α中，细菌转化及克隆筛选，质粒少量提取，酶切鉴定（质粒采用BamHⅠ和HindⅢ做双酶切鉴定），DNA测序鉴定。

1.2.4 重组质粒转染采用脂质体Lipofectamine 2000转染小鼠胚胎成纤维细胞3T3细胞株，荧光显微镜观察细胞，随机选取10个视野，荧光细胞数与总细胞数之比为转染效率。

1.2.5 转染后3T3细胞中Wnt—5a mRNA的表达情况采用RNeasy Mini试剂盒分离纯化各组细胞的总RNA，分光光度法测定计算提取的总RNA含量及浓度。根据GenBank上小鼠Wnt—5a的mRNA功能全长序列，采用Primer 5.0设计一对引物，其引物序列如下：Sense5′—GGCATCAAGGAATGCCAGTA—3′，Antisense 5′—GTACGTGAAGGCCGTCTCTC—3′，扩增产物的片段长度为120 bp。设计并合成内参照β—actin引物，Sense 5′—TGAGCGCAAGTACTCTGTGTGGAT—3′ ，Antisense 5′—ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA—3，扩增产物的片段长度为95 bp。参照OneStep RT—PCR试剂盒实验操作说明进行RT—PCR，以空白组为对照，采用2—△△CT法计算Wnt—5a mRNA的相对表达量。

2 结果

2.1 目的基因Wnt—5a的克隆

提取小鼠组织总RNA经RT—PCR获得目的基因，琼脂糖凝胶电泳分析显示片段长度约1.4 kb ，片段大小与预期值一致（图1）。

图1 Wnt—5a目的基因电泳结果

2.2 重组质粒PMX—IRES—Wnt5a的构建与鉴定

将PMX—IRES—GFP逆转录病毒载体经BamHⅠ和HindⅢ双酶切后与上述PCR纯化产物连接获得重组质粒，酶切鉴定（质粒采用BamHⅠ和HindⅢ做双酶切鉴定），DNA测序鉴定。测序结果经BLAST比较与GenBank上收录的原始序列一致。

2.3 重组质粒转染

转染72 h后，荧光显微镜观察可见大量绿色荧光，提示转染成功，转染效率为4×107 TU/mL。

2.4 转染后3T3细胞中Wnt—5a mRNA的表达情况

与空白组比较，Wnt—5a表达明显增高（图2）。电泳结果显示Wnt—5a扩增产物的片段长度为120 bp，内参照β—actin扩增产物的片段长度为95 bp，与预期结果一致，表明重组质粒转染成功（图3）。

图2 转染7 d后3T3细胞中Wnt—5a mRNA的相对表达水平

图3 RT—PCR检测转染后3T3细胞中Wnt—5a mRNA的表达

3 讨论

大面积烧伤患者创面愈合后常常会发生瘢痕挛缩畸形，加上自体皮源的匮乏，给后期整复带来了很大的困难。复合皮（composite skin）的出现为解决这一难题提供了一种新的临床治疗方法[1]。当前烧伤医学强调在挽救生命的基础上重视患者生存质量的改善，复合皮移植虽然使深度烧伤患者皮肤的部分功能得到改善或恢复，但由于缺乏必要的皮肤附属器官如皮脂腺、汗腺、毛囊，导致皮肤干燥、温度失衡，严重影响了患者的生存质量[2]。如何在复合皮中实现毛囊、汗腺等附件的重建及皮肤附件再生机制的研究是复合皮移植研究的未来发展趋势。

汗腺、皮脂腺大多通过毛囊开口于皮肤表面，毛囊再生是皮肤功能性再生的标志；传统观点认为受损皮肤的毛囊是无法自主再生的，国外学者在《Nature》上发表的最新研究报告表明毛囊可以再生[3，4]，研究人员利用成年鼠制造全层皮肤损伤模型，结果发现伤口中间会长出新毛，老鼠皮肤伤口的毛囊再生过程类似于胚胎毛囊发育过程的变化；静止的胚胎分子信号途径被“唤醒”，将皮肤干细胞送至皮肤受损处；这些稍后分化为可再生毛囊的干细胞，并非通常与毛囊再生相关的毛囊干细胞，而是来自表皮细胞[3]。

研究人员发现通过构建Wnt逆转录病毒载体，增强表达Wnt基因的分子信号，老鼠可以长出更多毛发[4]。越来越多的证据表明，Wnt基因是毛囊再生过程中的关键基因[5]；且Wnt—5a作为单基因就能够诱导、促进皮肤干细胞迁移至受损皮肤形成毛囊[6]。

大量资料证明Wnt信号具有多种生物学功能，广泛存在于各种不同物种的生物发育及疾病发生过程中。Wnt途径也参与了外胚层组织器官的生物学过程，具有调控皮肤及其附属器的发育，诱导皮肤干细胞向皮肤附件的形态发生，调节毛囊的周期生长，促进创面修复等功能。因此，通过病毒转染皮肤干细胞，以无细胞真皮替代物为载体，诱导皮肤干细胞高表达Wnt信号从而促进皮肤干细胞迁移至受损皮肤并定向分化、增殖形成毛囊，有可能成为解决皮肤功能性重建的新的途径。

但是，异种真皮基质和自体真皮基质毕竟存在很大差异， Wnt信号转导通路在异种真皮基质中是如何诱导、促进皮肤干细胞迁移至受损皮肤形成毛囊，是否存在其他关键的信号分子，毛囊再生不同阶段信号通路转导有无异同，针对毛囊再生过程中复杂的分子机制去如何进行多基因靶点协同调控以提高毛囊再生效率等问题有待解决，因此对Wnt信号转导通路的深入研究不仅使复合皮移植毛囊再生机制得到进一步的阐明，也将给烧伤患者的皮肤功能性重建提供了新的有效治疗途径。 本研究构建了Wnt—5a逆转录病毒载体，并成功转染3T3细胞，为进一步研究Wnt信号通路刺激诱导皮肤分化增殖及毛囊再生的机制奠定了基础。

[参考文献]

[1]陈璧，汤朝武，龚熙，等. 复合皮移植的实验研究与临床应用[J]. 中华烧伤杂志，2004 ，20（6）：347—350.

[2]Martin P. Wound healing——aiming for perfect skin regeneration[J]. Science，1997，276（5309）：75—81.

[3]Chuong CM. Regenerative biology：new hair from healing wounds[J]. Nature，2007，447（7142）：265—266.

[4]Ito M，Yang Z，Andl T，et al. Wnt—dependent de novo hair follicle regeneration in adult mouse skin after wounding[J]. Nature，2007，447（7142）：316—320.

[5]Reya T，Clevers H. Wnt signalling in stem cells and cancer[J]. Nature，2005，434（7035）：843—850.

[6]Fathke C，Wilson L，Shah K，et al. Wnt signaling induces epithelial differentiation during cutaneous wound healing[J]. BMC Cell Biol，2006，7：4.

（收稿日期：2012—04—01）