长期运动训练对外周血淋巴细胞DNA损伤和凋亡的影响及机制研究

代志军　朱荣

摘要：训练组（男子足球运动员，n=16）和对照组（男子大学生，n=16）在功率自行车上完成一次递增负荷力竭运动。运动前、运动后以及运动后24 h采集静脉血，测定外周血淋巴细胞计数、淋巴细胞凋亡率、羟自由基、8—羟基脱氧鸟嘌呤（8—OHdG）和8—氧鸟嘌呤DNA糖基化酶（OGG1）。结果发现，运动后即刻，训练组和对照组外周血淋巴细胞计数（P<0.01；P<0.05）、淋巴细胞凋亡率（P<0.05；P<0.01）、羟自由基（P<0.01；P<0.01）、8—OHdG（P<0.01；P<0.01）和OGG1（P<0.01；P<0.01）均高于运动前水平，而训练组OGG1升高幅度高于对照组（P<0.01），其他各指标升高幅度则均明显低于对照组（均为P<0.01）。运动后24 h，对照组外周血淋巴细胞计数低于运动前（P<0.01），淋巴细胞凋亡率高于运动前（P<0.01），而训练组则恢复至运动前；两组8—OHdG（P<0.05；P<0.01）均高于运动前，但升高幅度明显低于对照组（P<0.01）；OGG1在对照组恢复至运动前，而训练组仍高于运动前水平（P<0.05）。因此，长期运动训练通过降低氧化应激水平、提高DNA修复能力、减轻DNA氧化损伤，抑制运动性淋巴细胞凋亡。

关键词：运动训练；外周血淋巴细胞；DNA损伤；细胞凋亡；DNA修复酶

中图分类号：G804.7 文献标识码：A文章编号：1006—2076（2012）03—0060—06

Abstract：Training group （male football athletes， n=16） and control group （male normal undergraduate students， n=16） performed a bout of incremental exhausted exercise test on cycle ergometer. Peripheral blood lymphocyte counts， apoptotic rate of leukocytes， hydroxy radical，8瞙ydroxydeoxyguanosine （8—OHdG） and 8—oxoguanine DNA glycosylase （OGG1） were determined in venous blood before， immediately after and 24 h after exercise test. We found that although lymphocyte count（P<0.01； P<0.05）， apoptotic rate（P<0.05； P<0.01）， hydroxyl radical（P<0.01；P<0.01）， 8—OHdG（P<0.01；P<0.01） and OGG1（P<0.01；P<0.01） increased immediately after exercise test in both groups， the change extent of OGG1 in training group

收稿日期：2012—02—22

基金项目：浙江省教育厅科研计划项目（Y201017123）。

作者简介：代志军（1971— ），男，山东潍坊人，硕士，讲师，研究方向篮球教学与训练。

作者单位：1. 潍坊学院，山东 潍坊 261061；2. 温州医学院，浙江 温州 325035

1. Weifang University， Weifang 261061， China；2. Wenzhou Medical College， Whnezhou 325035， China

was significantly higher than that of control group （P<0.01）， while that of other indexes were lower than control group （all P<0.01）. After 24h， lymphocyte count was lower （P<0.01）， apoptotic rate was higher（P<0.01） than that of pre—exercise in control group， which were recovered in training group； 8—OHdG in both group were higher （P<0.05；P<0.01）than pre—exercise but elevation range in training group was lower than control group （P<0.01）； OGG1 recovered in control group， while higher than pre—exercise in training group （P<0.05）. In conclusion， attenuated oxidative stress， improved DNA repair ability and decreased lymphocyte oxidative DNA damage could be the mechanism to prevent exercise induced lymphocytes apoptosis through long—term exercise training.

Key words：exercise training； peripheral blood lymphocyte； DNA damage； apoptosis； DNA repair enzyme

运动可影响免疫系统的机能，其中大强度（剧烈）运动可抑制免疫，表现为运动后外周血淋巴细胞计数降低，上呼吸道感染的发病率升高。研究表明，运动性免疫抑制的发生与运动诱导的淋巴细胞凋亡密切相关，而运动氧化应激造成的DNA损伤是细胞凋亡的主要原因。此外，机体还存在DNA损伤抵御系统，即针对DNA氧化损伤进行有效修复，人体最重要的修复酶是8—氧鸟嘌呤DNA糖基化酶（8—oxoguanine DNA glycosylase，OGG1）。有研究显示，运动诱导的淋巴细胞氧化应激和细胞凋亡与受试者的身体机能状态有关，即经过长期训练者（如运动员）其氧化应激和细胞凋亡的程度要明显低于普通人群，但至今其机制未明。本研究旨在观察长期运动训练对一次力竭运动后外周血淋巴细胞凋亡的影响，并探讨氧化应激、DNA损伤、OGG1表达在其间的作用。

1 研究对象与方法

山东体育学院学报

第28卷第3期

2012年6月 代志军，等 长期运动训练对外周血淋巴细胞DNA损伤和凋亡的影响及机制研究

No.3 20121.1 研究对象

选择潍坊学院体育系男子足球运动员16名（训练年限超过2年，每天训练超过2 h，每周5次），对照组为身高、体重、年龄与训练组相匹配的本校非体育专业男性大学生16名（无规律运动习惯，即每天运动不超过20 min，每周不超过2次）。受试者身体健康，均无心血管疾病、糖尿病、慢性感染、骨骼肌肉病史及其他严重疾患病史、无常规用药史（包括营养补剂）、无烟酒嗜好。受试者的一般情况。

1.2 一次递增负荷力竭运动实验

运动实验在潍坊学院运动人体科学实验中心进行，实验室环境：氧浓度20.9%，CO2浓度小于300 ppm，温度26℃，相对湿度40%～50%，气压760 mmHg。利用功率自行车（Monark 839E，瑞典）进行一次递增负荷力竭运动实验，力竭实验方案：训练组和对照组先进行10 min准备活动（拉伸与慢跑）后，适应性蹬车2 min（无负荷），随后进行正式实验：训练组起始负荷为100 W、每分钟递增25 W，对照组起始负荷为30 W，每2 min递增30 W，两组均保持60 r/min的转速，直至力竭。力竭判断标准：达到年龄标准化最大心率[220—年龄（岁）]，或者经再三鼓励，实验对象仍不能按规定强度完成运动视为力竭。注意事项：所有受试者在实验前48 h内均未进行过剧烈运动，签订知情同意书后填写PAR—Q问卷，问卷中7个问题均回答“否”者可参加本实验。整个过程在心电监护（Mac120，日本）以及两名专业医师陪同下进行。

1.3 取血

受试者于运动实验前半小时、运动后即刻以及运动后24 h，空腹状态下于肘静脉分别采血10 mL，加入EDTA抗凝。

1.4 淋巴细胞计数测定

取500 μL抗凝血，测定淋巴细胞计数（全血分析仪，MICROS60，美国）。单位cell/μL。

1.5 淋巴细胞分离

使用密度梯度离心法分离淋巴细胞。取抗凝血用磷酸盐缓冲液（PBS）等倍稀释后，缓慢加入等体积的淋巴细胞分离液（Ficoll—Pague溶液，深圳晶美生物工程有限公司），3 000 rpm离心30 min，取淋巴细胞层，用PBS洗涤两次，3 000 rpm离心5 min，弃上清。RPMI 1640（Gibco公司，美国）培养液再悬浮，加入10%小牛血清、青霉素和链霉素进行细胞培养，密度为2.5×105 cells/mL。

1.6 淋巴细胞凋亡率测定

流式细胞法检测淋巴细胞凋亡率。用预冷PBS洗细胞两次，用250 μL结合缓冲液重悬细胞，浓度调整为1×106 cells/mL，取100 μL细胞悬液于5 mL流式管中，加5 μL Annexin V—FITC（深圳晶美生物工程有限公司）和10 μL 20 μg/mL碘化丙锭溶液，混匀后于室温避光孵育15 min，加入400 μL PBS，流式细胞仪分析（EPICS—XLⅡMCL，美国Beckman公司；分析系统软件为SystemⅡ）结果。

1.7 淋巴细胞8—羟基脱氧鸟嘌呤（8—OHdG）测定

用ELISA（酶联免疫吸附实验）法测定淋巴细胞8—OHdG。用DNA提取试剂盒（南京建成生物公司）提取淋巴细胞DNA。DNA在TE缓冲液中溶解至20～50 μg/mL，在230 nm、260 nm和280 nm三个波长条件下检测吸光度，并计算DNA的浓度，检测其纯度。取200 μg DNA加至135 μL双蒸水中，加入15 μL乙酸钠、6 U的核酸酶P1至DNA溶解液中，37℃ 孵育30 min。加入1M Tris—HCl缓冲液及2 U碱性磷酸酶，37℃孵育30 min。水解产物过纯化柱，1 4000 rpm离心10 min。收集离心的液体，取50 μL DNA用ELISA试剂盒（深圳晶美生物工程有限公司）检测8—OHdG的含量（ng/mL），检测步骤按试剂盒说明书进行。

1.8 淋巴细胞羟自由基测定

依照试剂盒（南京建成生物公司）说明，将lucigenin5（μmol/L）和细胞悬液（5×104/ml）加入预热Krebs/Hepes缓冲液（37℃），反应体系5ml。试管放入紫外分光光度计，1 cm光径，检测波长550 nm，蒸馏水调零，测各管吸光度值，只加lucigenin不加细胞的试管是空白对照。超氧阴离子和羟自由基含量为测试管与空白管吸光度差值，单位为KU/L。

1.9 淋巴细胞OGG1蛋白表达测定

考马斯亮蓝法测定蛋白含量，蛋白样品经15% SDS—PAGE分离转移于PVDF膜。一抗（Santacruz公司）孵育过夜，HRP标记二抗（TBD公司）孵育1小时，ECL显影。采用凝胶系统分析软件扫描各条带灰度值，以对照组运动前条带为100%，其它各条带与其比值，即其相对表达量（%）。β—actin为内参蛋白。

1.10 统计方法

所有数据均用SPSS 14.0统计软件包进行处理，结果用平均数±标准差表示，组内各时间点比较使用单因素方差分析，组间比较使用独立样本t检验。P<0.05为显著性水平，P<0.01为非常显著水平。

2 研究结果

2.1 一次力竭运动前后淋巴细胞计数与淋巴细胞率的变化

运动前安静时，训练组淋巴细胞计数低于对照组（P<0.01），淋巴细胞凋亡率则高于对照组（P<0.01）；运动后即刻，两组淋巴细胞计数（P<0.01；P<0.05）、淋巴细胞凋亡率（P<0.05；P<0.01）均高于运动前，训练组淋巴细胞凋亡率升高的幅度明显低于对照组（48% vs 163%，P<0.01）；运动后24 h，对照组淋巴细胞计数低于运动前（P<0.01），淋巴细胞凋亡率高于运动前（P<0.01），而训练组则均恢复至训练前水平。

运动前安静时，训练组羟自由基高于对照组（P<0.01），两组8—OHdG无显著性差异（P>0.05）；运动后即刻，两组羟自由基（P<0.01；P<0.01）与8—OHdG（P<0.01；P<0.01）均高于运动前，但训练组升高的幅度明显低于对照组（羟自由基：51% vs 126%，P<0.01；8—OHdG：52% vs 86%，P<0.01）；运动后24 h，两组羟自由基均恢复至训练前水平，两组8—OHdG仍高于运动前（P<0.05；P<0.01），但训练组升高的幅度明显低于对照组（23% vs 51%，P<0.01）。

3 讨论

本研究中，一次力竭运动后即刻，训练组和对照组淋巴细胞计数均明显升高，与前人的研究一致。这是由于运动中儿茶酚胺等物质分泌增加，促使淋巴细胞从肝、脾、淋巴结和胸腺等白细胞池释放，从而影响了血液淋巴细胞的浓度。一般在运动后数小时淋巴细胞数量开始减少，研究发现，不论是运动员还是普通人，剧烈运动后2～4 h可造成暂时性的淋巴细胞减少症。在本研究中，力竭运动24 h后，对照组淋巴细胞计数明显减少，而训练组与运动前无显著性差异，虽然我们没有在0—24h之间取观察点，但结合前人的研究，我们认为，训练组在力竭运动后的恢复期（0～24 h之间）必定存在淋巴细胞显著减少的时相，而在运动后24 h这一时间点，训练组淋巴细胞数量已恢复至运动前水平。这说明长期运动训练可明显提高淋巴细胞对运动刺激的耐受性，同时提示长期运动训练可缩短运动性免疫抑制恢复的时间。Malm等的研究显示，连续5天的大强度运动训练后24 h，淋巴细胞计数仍未恢复，这与选择的训练方案与施加的训练负荷有关。

细胞凋亡是免疫系统保持稳态并抵御疾病的主要调节机制。研究证实，细胞凋亡参与了运动后淋巴细胞数量的调控。应用TUNEL法，Mars等首次报道了剧烈运动后淋巴细胞凋亡现象。随后的研究显示，淋巴细胞凋亡具有运动强度依赖性。本研究证实，不同的身体机能状态是影响安静时和运动后淋巴细胞凋亡的重要因素之一。安静时训练组淋巴细胞凋亡率略高于对照组，这与安静时训练组淋巴细胞计数稍低于对照组是一致的。研究表明，淋巴细胞保持一定凋亡水平有益于刺激淋巴器官中淋巴细胞的增殖与释放，是机体的一种自我调节机制。力竭运动后对照组淋巴细胞凋亡率升高幅度明显高于训练组，24 h后训练组恢复至运动前水平，而对照组仍居高不下，提示运动员经过长期运动训练，机体已建立了抵抗运动诱导淋巴细胞凋亡的适应机制，缺乏运动习惯者在剧烈运动应激刺激下则更易发生淋巴细胞凋亡和淋巴细胞减少症（运动性免疫抑制）。结合两组淋巴细胞计数的变化，我们认为，训练组淋巴细胞凋亡的减少和凋亡的迅速恢复防止了淋巴细胞数量的降低。

运动造成细胞氧化还原状态的改变是淋巴细胞凋亡最重要的机制之一，其初始信号为细胞内自由基的增多。在本研究中，两组淋巴细胞羟自由基在运动后即刻均显著升高，自由基可造成线粒体膜电位（MTP）去极化，线粒体膜间隙的某些蛋白如细胞色素C、凋亡诱导因子（AIF）随之释放入胞浆，分别通过激活细胞内的蛋白水解酶如caspase和依赖于caspase的直接染色质凝聚作用（chromatin condensation），从而启动了凋亡通路。运动后即刻，训练组淋巴细胞羟自由基升高的程度明显低于对照组，提示长期运动训练可提高机体的抗氧化水平、减轻氧化应激反应，这是通过细胞内的自由基清除系统（谷胱甘肽、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等）表达上调实现的。因此，相对于普通人群，运动员在运动应激后其细胞凋亡程度明显减轻。运动后24 h两组淋巴细胞羟自由基均恢复至运动前水平，研究证实，急性运动后自由基显著升高，但一般在运动后24 h恢复。Viguie等报道，升高的淋巴细胞超氧化物在运动后1 h即降至安静水平，提示运动后24 h内氧化应激指标即可恢复。运动中和运动后数小时氧化应激水平的暂时性升高可能是本研究中淋巴细胞DNA损伤和细胞凋亡的重要原因。值得注意的是，安静时训练组淋巴细胞羟自由基高于对照组，一方面解释了训练组安静时淋巴细胞凋亡率稍高于对照组的现象，有利于淋巴细胞的更新；另一方面，较高的氧化应激状态可对机体产生保护作用，因自由基可激活肿瘤抑制基因（如p53）的表达，从而清除变异细胞并抑制肿瘤形成与发展，这也是长期运动训练的积极效应。

氧化应激诱导的DNA损伤参与了运动诱导的细胞凋亡过程，研究指出，淋巴细胞DNA单链断裂与运动强度成正比。8—OHdG是DNA氧化损伤后形成的碱基修饰产物，为DNA脱氧鸟苷的C8位受到羟自由基的攻击而形成。机体修复机制正常时，8—OHdG 可以在OGG1的作用下从DNA链上切除并重新掺入正常的鸟嘌呤碱基。因此，8—OHdG是DNA氧化损伤的生物标志物，而OGG1则代表DNA修复系统的功能。本研究中，两组淋巴细胞8—OHdG在运动后即刻以及运动后24h均显著高于运动前，表明运动诱导的氧化应激状态可使DNA损伤持续存在。Okamura等的研究显示，连续8天的训练后尿8—OHdG增加，而淋巴细胞8—OHdG未发生改变，并认为是由于淋巴细胞强大的DNA修复系统的保护作用所致，研究结果的差异可能与受试者选取与训练方法有关。力竭运动后及24 h训练组淋巴细胞8—OHdG升高幅度显著低于对照组，而OGG1升高幅度则显著高于对照组，提示长期运动训练可显著提高DNA修复能力，运动后DNA损伤明显减轻。此外，运动还可促进核编码的OGG1向线粒体转位，增强线粒体DNA损伤的修复，这在一定程度上对运动诱导的淋巴细胞凋亡起抑制作用。安静时两组淋巴细胞8—OHdG无显著性差异，这可能与受试者的选取有关。虽然训练组淋巴细胞羟自由基高于对照组，但本研究的受试者均为20岁左右的年轻男性，两组OGG1在运动前安静时无显著性差异，说明DNA修复功能均处于较高水平，因此，DNA氧化损伤能够被迅速修复。有趣的是，运动后24 h，训练组淋巴细胞凋亡率已恢复正常，但淋巴细胞8—OHdG仍高于运动前水平，这是因为虽然力竭运动导致DNA损伤，但并不表示损伤的细胞一定产生凋亡。训练组运动后24 h OGG1仍高于运动前水平，说明此时DNA修复过程仍在继续，某些损伤的细胞可能重新被拯救而免于凋亡。此外，还可能与凋亡细胞的清除率有关。凋亡细胞清除是外周免疫应答的最后步骤，并依赖于单核—巨噬细胞的吞噬活性，这一过程将对免疫应答产生复杂的影响。若清除不及时，将发生自身免疫甚至癌症，若过度清除则产生淋巴细胞减少症和免疫缺陷病。剧烈运动后常伴随淋巴细胞减少症，因此，运动后凋亡细胞的过度清除可能也是本研究中训练组淋巴细胞凋亡率在运动后24 h恢复正常的原因之一。

4 结论

4.1 长期运动训练可造成机体免疫系统的慢性氧化应激状态，表现为安静时淋巴细胞羟自由基升高、淋巴细胞凋亡率较高，而淋巴细胞计数较低。

4.2 一次力竭运动可通过产生羟自由基使淋巴细胞DNA氧化损伤，启动线粒体凋亡通路，促进淋巴细胞凋亡。

4.3 长期运动训练通过降低氧化应激水平、提高DNA修复能力、减轻DNA氧化损伤，抑制运动性淋巴细胞凋亡。

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