补充枸杞对力竭运动大鼠骨骼肌超微结构变化的影响

葛新发,董贵俊，王宏巍,王超,李可峰，潘卫东

摘 要：枸杞是运动员饮食中常用的营养补剂，对运动后体能恢复、免疫能力提高等具有重要作用。为了研究补充枸杞对力竭运动后大鼠骨骼肌超微结构变化的影响，对Wistar大鼠6周枸杞灌喂后进行一次性力竭运动，观察运动后即刻、24 h、48 h、72 h的大鼠比目鱼肌超微结构变化。发现力竭运动导致大鼠比目鱼肌在运动后即刻至48 h间超微结构出现显著变化，表现为Z线的紊乱、肌纤维断裂、线粒体结构改变及肌核内移等现象。表明补充枸杞能显著改善力竭运动后即刻至48 h比目鱼肌超微结构损伤，加速骨骼肌超微结构损伤恢复。

关键词：大鼠；枸杞；比目鱼肌；超微结构

中图分类号：G804.7 文献标识码：A 文章编号：1006—2076（2012）04—0046—05

Abstract：As one of nutritional supplements in athletes diet， wolfberry plays an important role in physical and immunity recovery after exercise. In order to study the effects of wolfberry on rat skeletal muscle ultrastructure after exhaustive exercise， rats were exercised exhaustive after six weeks supplement wolfberry and were observed ultrastructural changes of the soleus muscle in 0h， 24h， 48h and 72h after exhaustive exercise. The results showed that ultra—microstructure of rat soleus were changed significantly from 0h to 48h after exhaustive exercise with fractured muscle fiber， muscle interstitial edema， inflammatory cell infiltration and myocyte necrosis degeneration. Added wolfberry can significantly improve the ultrastructure of micro—damage in soleus muscle from 0h to 48h after exhaustive exercise， which show complement wolfberry accelerate recovery of skeletal muscle ultrastructure and skeletal muscle micro—damage repair after exhaustive exercise.

Key words：rats； wolfberry； soleus； ultrastructure

枸杞是一种传统名贵药材，具有“红宝”之称，其成分为枸杞多糖、甜菜碱等及多种微量元素和氨基酸[1]。枸杞具有的延缓疲劳、抗氧化、滋阴补肾等作用可能与枸杞多糖及血清酶存在的指标关系相关联[2]。同时，枸杞水煎液、提取物、口服液能有效提高小鼠持续游泳时间，说明枸杞能显著提高小鼠的抗疲劳能力[2—3]；对机体补充枸杞多糖能降低血清中乳酸含量，提高骨骼肌在运动过程中利用氧的能力以及心血管系统供氧能力，增强机体的有氧代谢能力等[3—5]。在力竭运动中，补充枸杞能够明显改善机体成分，提高机体的运动能力，有效预防肌肉损伤的发生。力竭运动可导致循环血量重新分布及大量乳酸的堆积，肌细胞膜受损，线粒体双层膜结构破坏、嵴消失且血清酶活性升高，补充枸杞能有效缓解血清酶上升幅度，从而起到对肌纤维的保护作用[6]。目前对枸杞在运动过程中的研究主要集中在运动训练中抗疲劳作用的生理、生化指标的分析，对力竭运动后恢复过程中骨骼肌超微结构变化的影响研究尚未发现。

本研究通过对大鼠进行一次性力竭运动后引起的骨骼肌超微结构的变化进行研究，观察补充枸杞后大鼠力竭运动引起骨骼肌超微结构的变化，从组织学分析补充枸杞对力竭运动中大鼠骨骼肌超微结构的影响，探讨补充枸杞对大鼠比目鱼肌损伤恢复的促进作用。

1 材料与方法

1.1 动物分组及喂养方法

购自山东大学动物饲养中心雄性Wistar大鼠共90只，体重157.6±6.0 g，室温保持在23℃左右，相对湿度（55±5）%，光照时间为7：00—19：00，自由饮食。随机分为6个组，其中自由饮食组、补充安慰剂组、补充枸杞组作为对照组（每组6只），自由饮食运动组、补充安慰剂运动组、补充枸杞运动组作为运动组（每组24只）。

1.2 枸杞灌喂方式

将枸杞用蒸馏水洗干净后浸泡30分钟，分两次煎煮，每次煮沸后加煮10分钟，分别过滤一起摇匀，制成浓度相当于生药量1 g/ml 的100%的水煎剂，灌喂剂量为10 g/kg体重。补充安慰剂组灌喂相同剂量的生理盐水。每天称重两次，以根据体重确定补充的剂量[1]。

1.3 运动的条件及方案

实验对照组及运动组实验均为期6周，然后利用动物实验运动跑台力竭运动一次，参照文献力竭运动前让大鼠跑台适应1周，第一天以5 m/min，第二天以10 m/min，第三天以15 m/min的速度运动直到1周 ，每次运动持续15 min。休息1天，进行运动（25 m/min，5%坡度，相当于75%VO2max）[8]。力竭组以大鼠臀部压在跑台后壁，后肢随转动皮带后拖达30秒以上，驱赶无效，并有呼吸加深的现象、神态倦怠、俯卧位、垂头等特征为力竭标准。

1.4 样本取材及电镜标本制作

观察运动组运动后即刻、24 h、48 h、72 h的大鼠比目鱼肌超微结构变化。力竭运动后即刻、24 h、48 h、72 h取大鼠两侧的比目鱼肌，将一侧比目鱼肌组织放入冰冷的生理盐水中清洗，统一标记并冻存，而将另外一侧的比目鱼肌组织切割成0.5 mm×0.5 mm×5 mm的长方体块状标本，立即置于2.5%戊二醛固定液中固定，0℃～4℃保存。

2.5%戊二醛固定骨骼肌的标本后，将标本置于4℃ 的0.1 M PBS缓冲液中过夜保存，取出后充分在缓冲液中以大概15分钟的间隔冲洗4次，然后加1%饿酸同样放置在4℃的环境内固定2 h，再用以上同样的方式在缓冲液中进行冲洗，完毕后用梯度乙醇丙酮脱水，环氧树脂包埋，然后把包埋的标本块切制成半薄切片，随后光镜定位，再用超薄切片机进行切片，切片最后用铀—铅双染制片。

2 实验结果

2.1 自由饮食组、补充安慰剂组、补充枸杞组大鼠比目鱼肌超微结构

自由饮食组、补充安慰剂组、补充枸杞组电子显微镜下均显示肌纤维排列整齐，肌节形态正常、结构完整，A、I、H带以及M线完整清晰，肌膜、核膜完整，线粒体、肌核完整，Z线完整连续，无异常现象（见图1）。

2.2 力竭运动后即刻大鼠比目鱼肌超微结构变化情况

运动组运动后即刻切片均显示明显的Z线不连续，呈波纹状，其完整性被破坏，并出现肿胀的线粒体；自由饮食、补充安慰剂运动组与补充枸杞运动组相比，Z线排列更加紊乱。

2.3 力竭运动后24 h大鼠比目鱼肌超微结构变化情况

力竭运动后24 h自由饮食组与安慰剂组超微结构的损伤明显，损伤程度高于即刻组，损伤程度严重，如大量线粒体发生肿胀，肌核肿胀，固缩，空泡变性，嵴紊乱，肌膜皱缩，肌细胞肿胀，Z线出现异常，部分肌基膜分离，部分肌膜出现溶解现象。巨噬细胞、间质可见炎性细胞等（如图4）。运动后24 h补充枸杞组的损伤情况比补充即刻组有所增加，与运动后24 h自由饮食组和安慰剂组相比较轻（如图5），线粒体在体积上有肿胀现象，其数目稍微增多，肌细胞肿胀，Z线异常，嵴紊乱，巨噬细胞、间质可见炎性细胞等，属局灶性损伤。

2.4 力竭运动后48 h大鼠比目鱼肌超微结构变化情况

力竭运动后48 h自由饮食组与安慰剂组超微结构的损伤有减轻的趋势，出现逐渐修复现象。损伤程度在局灶性与严重之间，如线粒体发生肿胀、肌核肿胀，固缩，空泡变性，嵴紊乱，肌膜皱缩，肌细胞肿胀，Z线出现异常，部分肌基膜分离，部分肌膜出现溶解现象。巨噬细胞、间质可见炎性细胞等（如图6），属局灶性损伤。运动后48 h补充枸杞组的损伤情况轻于补充枸杞24 h组、自由饮食与安慰剂48 h组（如图7），线粒体在体积上有肿胀现象，其数目稍微增多，肌细胞肿胀，Z线异常，嵴紊乱，间质偶见具有增殖趋势的卫星细胞等，属局灶性损伤。

2.5 力竭运动后72 h大鼠比目鱼肌超微结构变化情况

自由饮食组与安慰剂组力竭运动后72 h与48 h相比超微结构的损伤逐渐好转出现修复，线粒体在体积上有肿胀现象，其数目稍微增多，肌细胞肿胀，基膜部分分离，Z线异常，嵴紊乱，间质偶见具有增殖趋势的卫星细胞等（如图8）。运动后72 h补充枸杞组的损伤情况在修复周期过程中明显优于自由饮食组与安慰剂组（如图9）。卫星细胞在间质中出现增殖，肌细胞中的染色质有凝聚现象出现，基膜逐渐形成，向卫星细胞慢慢转变。

3 讨论

长时间或力竭运动后造成的骨骼肌纤维结构的改变，称运动性骨骼肌微细损伤。这种损伤的发生有复杂的多种因子参与，其损伤机制也有很多的假说，如代谢学说、机械学说、自由基学说等。这些学说均认为，胞浆内容物泄漏以及胞外钙离子大量进入是肌细胞膜的损伤、完整性丧失的直接原因[8]，而细胞膜结构的损伤后会引起一系列肌纤维微结构的改变。所以，运动中若能通过对机体补充营养补剂来维持肌细胞膜的正常功能及完整性，可减轻肌肉微损伤的程度，维持运动员的运动能力及身体机能。

在电子显微镜观察下，骨骼肌超微结构的变化以肌小节形态结构改变为主要表现形式，如肌原纤维排列紊乱，Z线排列不整齐，线粒体数量减少。骨骼肌超[LL]微结构的变化与运动时间、强度等均有关，时间持续越长、强度越大及非习惯性负荷，运动损伤越明显。

造成骨骼肌微损伤的运动方式以离心运动最为显著，尤其是下坡跑台运动，目前大量的研究都证实了这个观点[9—11]，在运动训练中骨骼肌延迟性酸痛现象很常见，这些现象被认为是一个从刺激到适应的过程[12]。本研究中，大鼠在进行一次性力竭离心运动后，骨骼肌的超微结构表现出了同样的明显变化。研究发现骨骼肌运动后即刻至24 h超微结构的变化表现为：肌纤维断裂，Z线异常、出现波纹状，线粒体空泡化。这一系列变化在24 h以后取样切片中最明显，其中肌节明、暗带的排列紊乱是骨骼肌形态学在电镜下观察的一些现象[6，12—13]。这些微变化都是机体对长时间、大强度、非习惯性负荷刺激所做出的反应。本研究结果发现补充枸杞可减轻力竭运动后大鼠比目鱼肌超微结构的一系列形态学的改变。运动后48 h，补充枸杞组骨骼肌微损伤修复速度明显优于自由饮食组和安慰剂组，说明补充枸杞在运动训练过程中对骨骼肌的损伤有明显的预防及促进修复作用。

4 结论

力竭运动导致大鼠比目鱼肌在运动后即刻至48 h间超微结构出现显著变化，表现为肌纤维断裂、Z线改变、线粒体减少等。补充枸杞能显著改善力竭运动后48 h比目鱼肌超微结构微损伤状况，表明枸杞在运动训练过程中对骨骼肌的损伤存在保护作用，对力竭运动后骨骼肌微损伤的修复具有促进作用。

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