软肝颗粒的工艺设计

2012-04-25广东省深圳市中医院张尚斌廖伟明曾鹏宇深圳518033

河北中医药学报 2012年3期

广东省深圳市中医院张尚斌廖伟明曾鹏宇（深圳 518033）

1 实验仪器与材料

1.1 仪器紫外光灯（ZF－2型，上海市安亭电子仪器厂）、超声仪（HKD1002VS，深圳市和达设备有限公司）、高效液相色谱仪（SPA－M20A，日本岛津）、紫外分光光度计（UV－1800，SHIMADZU）。

1.2 材料丹参酮ⅡA对照品（110766－200416，中国药品生物制品检定所）;三七对照品（120941－200506，中国药品生物制品检定所）;三七对照药材（康美药业股份有限公司，批号:091205971）;阴性对照品（缺三七）;样品1（深圳中医院制品:批号090618）;样品2（深圳中医院制品:批号090910）。

2 方法与结果

2.1 提取工艺的研究将处方中五味子、丹参用乙醇渗漉，渗漉液、药渣备用;余药加入五味子、丹参药渣，加水煎煮2次，合并煎液，滤过后浓缩，放冷静置。取上清液，加入五味子、丹参渗漉液，浓缩成稠膏后制成颗粒。

2.2 定性鉴别

2.2.1 三七:取样品和阴性对照品（缺三七）各10 g，粉碎，加甲醇40 mL超声处理1 h，过滤，蒸干，残渣加水10 mL，用水饱和正丁醇萃取3次，每次20 mL，正丁醇液用氨试液洗3次，每次20 mL，再用正丁醇饱和的水洗3次，每次20 mL，蒸干，加甲醇1 mL作为供试品溶液。精密称取丹参酮ⅡA对照品10 mg，置50 m L棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。吸取上述4种溶液各12 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以三氯甲烷－乙酸乙脂－甲醇－水（15︰40︰2︰10）10℃以下放置的下层溶液为展开剂，展开，取出，凉干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热至斑点显色清晰，置日光下检视。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，分别显相同颜色的斑点。

2.2.2 丹参酮ⅡA:取本品10 g，加无水乙醚20mL超声处理10 min，滤过，滤液挥干，残渣加醋酸乙酯0.5 mL使溶解，作为供试品溶液。另取丹参酮IIA对照品，加醋酸乙酯制成每1 mL含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取对照品溶15μL，供试品溶10μL，分别点于同一硅胶 G薄层板上，以甲醇－－醋酸乙酯（19︰1）为展开剂，展开，取出，晾干。置日光下检视，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应位置上，分别显相同的橙红色斑点。［1］

2.3 丹参酮ⅡA有效成分的含量测定［2］

2.3.1 色谱条件:色谱柱:十八烷基合硅胶为填充剂。流动相:甲醇－水。检测波长:270 nm。柱温:室温。

2.3.2 对照品溶液的制备:精密称取丹参酮ⅡA对照品10 mg，置50 mL棕色量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（每1 mL中含丹参酮ⅡA 16μg）。

2.3.3 供试品溶液的配置:取本品若干，粉碎后精密称取3.00 g，精密加入甲醇30.00 mL，塞紧，称定重量，超声20 min后加热回流0.5 h，冷却至室温后称重，用甲醇补足减失量，摇匀，用微孔滤过膜（0.45μm）滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.3.4 样品测定:精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μL，注入液相色谱仪，用外标法测定。

2.4 单因素实验与结果通过对软肝颗粒的制备过程的考察，影响软肝颗粒疗效的因素有:加水量、提取时间、渗漉醇浓度、提取温度等，现对渗漉乙醇浓度、加水量、提取时间3个因素进行单因素实验研究，以确定相关因素及其范围，结果如下。

2.4.1 渗漉醇浓度影响:在加水量为8倍，提取时间为2 h条件下研究40%、65%、75%、85%、95%不同乙醇浓度对丹参酮ⅡA含量的影响，结果分别是0.438、0.577、0.612、0.630、0.623mg/g。由此可以看出，随着乙醇浓度的增加，丹参酮ⅡA的含量也在增加，在85%时到达最高值，之后丹参酮ⅡA轻微减弱。在85%的浓度前后，丹参酮ⅡA含量为最大而且变化不大。因此，选择75%、85%和95%这3个效果较好的乙醇浓度作进一步的正交实验。

2.4.2 加水量的影响:在渗漉醇浓度为85%，提取时间2 h条件下研究加水量为6、8、10、12、14倍，5个倍数对丹参酮ⅡA含量的影响，结果分别是0.335%、0.537%、0.593%、0.575%、0.523% 。由此可以看出，当加水量从6倍增加到10倍，丹参酮ⅡA含量上升;随着加水量的继续增加，丹参酮ⅡA含量又呈下降趋势。这是因为在中药煎煮提取过程中，在一定条件下，存在最佳加水量。当加水量过低时，溶剂不足以把物料中的物质提取出来;当加水量过多时，过多的水会起到稀释作用，从而影响丹参酮ⅡA含量。由此可知在10倍加水量前后，丹参酮ⅡA含量为最大而且变化不大。因此，选择8倍、10倍和12倍这3个效果较好的加水量做进一步的正交实验。

2.4.3 提取时间影响:在渗漉醇浓度为85%，加水量为10倍条件下，研究提取时间为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h，不同时间对丹参酮ⅡA含量的影响，结果分别是0.423、0.508、0.552、0.571、0.576 mg/g。由此可见，随着提取时间的增加，丹参酮ⅡA含量也在增加。而丹参酮ⅡA含量在0.5～1.5 h的时间内，增加速度较快;在2 h之后，丹参酮ⅡA含量随着时间的变化不大。故选择1.5、2.0、2.5 h这3个效果较好的提取时间做进一步的正交实验。

2.5 正交试验与结果根据预实验，对影响提取的主要因素为加水量（A），提取时间（B），还有渗漉醇的浓度（C）等3个因素进行L9（34）正交试验设计，以丹参酮ⅡA的有效成分为指标，优选最佳提取工艺。正交设计各因素水平情况见表1。

表1 软肝颗粒因素水平表

表2 正交试验的试验方案和实验结果

表3 方差分析结构

结果:从表2，表3直观分析和方差分析一起考察可见，渗漉醇浓度有显著影响，其他两个影响不明显不显著。所以，最后确定的最优工艺为A2B2C2，即渗漉醇浓度为85%，提取时间为2 h，加水量为10倍为最佳工艺条件。

2.6 优选提取工艺条件重复性试验为进一步考察上述优选工艺的稳定性，以工艺重复试验3次，即选用渗漉醇浓度为85%，提取时间为2 h，加水量为10倍，进行重复3次提取。结果试验号1、2、3的丹参酮ⅡA含量分别是0.672、0.683、0.669 mg/g，平均值为0.675 mg/g。表明:工艺A2B2C2，丹参酮ⅡA含量0.675±0.008，工艺稳定。且丹参酮ⅡA含量较高，证明工艺合理。

2.7 讨论与注意问题

2.7.1 波长的选择:对丹参酮ⅡA对照品溶液在波长200～400 nm处进行紫外光谱扫描检测显示，其波长270 nm处有最大吸收，与1995版药典采用的波长相同。

2.7.2 由于丹参酮ⅡA在操作过程中容易挥发，且遇光、遇热都不稳定，很容易造成丹参酮ⅡA含量不稳定，所以丹参酮ⅡA操作时间不宜太长，温度不宜太高，达到甲醇的沸点（64.5℃）即可。

2.7.3 工艺条件筛选部分使用了正交试验法并通过方差方法进行分析，虽然不能像全面试验那样对各因素效应、交互作用一一分析;当交互作用存在时，有可能出现交互作用的混杂。但它能通过部分试验找到最优水平组合。特点如下:完成试验要求所需的实验次数少，数据点的分布很均匀，可用相应的极差分析方法、方差分析方法、回归分析方法等对试验结果进行分析，引出许多有价值的结论。