松江鲈MyoD基因cDNA部分片段的序列和表达特征分析

蔡宝平，李风鸣，郑红梅，杨磊，邵芳，卢祥云，顾志良

（常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟 215500）

松江鲈MyoD基因cDNA部分片段的序列和表达特征分析

蔡宝平，李风鸣，郑红梅，杨磊，邵芳，卢祥云，顾志良

（常熟理工学院生物与食品工程学院，江苏常熟 215500）

生肌决定因子MyoD是生肌调节因子MRFs家族的一个重要成员，在基因转录调控中起着重要的作用.本实验通过RT-PCR和3’-RACE等方法，以松江鲈肌肉总RNA为模板，扩增出957 bp的MyoD基因部分序列，包含部分编码区长567 bp，编码翻译188个氨基酸残基，3’-UTR区长390 bp.系统发育分析表明，松江鲈MyoD与奥尼罗非鱼亲缘关系最近.不同组织半定量分析显示，松江鲈MyoD在各种组织中均有表达，在心脏中表达量最高，预示着在不同组织中该基因的功能广泛．

松江鲈；生肌决定因子；3’-RACE；组织表达

动物肌肉的形成是一个复杂的过程，受包括MRFs家族在内的多种细胞内转录因子的调控．MRFs家族由MRF4、MyoG、MyoD和Myf5四个基因组成．该家族基因具有一个保守的碱性螺旋-环-螺旋结构域（bHLH）[1]．通过该结构域，MRFs可以和E蛋白形成二聚体从而和下游靶基因如肌球蛋白轻链、肌酸激酶等基因上游的E-box（CANNTG）结合而激活该基因表达[2]．研究表明MyoD和Myf5首先在前体节细胞中表达，在体节功能的发挥及成肌细胞的形成中起重要作用，而MyoG和MRF4的表达要相对晚一点，在肌细胞的最终分化中起作用[3]．

MyoD基因是脊椎动物胚胎期肌肉发育的主导调控基因之一，在肌肉特异性基因转录调控中起着总开关的作用．MyoD主要在成肌过程中起作用，MyoD缺失可导致成肌细胞无法进行增殖和分化．MyoD所介导的肌分化机制是研究细胞分化的最佳模型．此外，MyoD基因通过影响MyoG基因的活性来间接影响肌细胞的终端分化过程．MyoD基因首先由Devis等发现并获得[4]，此后，对生肌调节因子的研究越来越受到人们的重视．迄今已克隆获得包括人、大鼠、小鼠、爪蟾、斑马鱼、奥尼罗非鱼等多种脊椎动物的MyoD基因[5]．

松江鲈（Trachidermus fasciatus）隶属于鮋形目，杜父鱼科，松江鲈鱼属．与黄河鲤、松花江鳜及兴凯湖白鱼并称中国四大名鱼．其肉质鲜美且含有丰富的不饱和脂肪酸及氨基酸等营养物质，具有很高的食用和经济价值．松江鲈是一种降河洄游性、营底栖生活的小型鱼类[6]．通常先在海水中孵化，然后再与海相通的淡水河川区域生长育肥．在我国境内，松江鲈主要分布在秦皇岛-渤海海区，鸭绿江-黄海海区，黄河-黄海海区，钱塘江-东海海区[7]．这些地理群体都有固定的天然产卵场．然而近年来因其栖息地遭到不同程度破坏已濒临灭绝，1994年被正式列为我国国家二级保护动物．目前对松江鲈的研究主要集中在生态、生理、胚胎发育与繁殖习性等方面[8]，但是对于松江鲈分子生物学方面的研究很少，且尚未有关于松江鲈的肌肉生长调节因子研究的报道．本实验克隆和测序松江鲈MyoD基因的3’-端序列．分析了其氨基酸序列在种群间的同源性，构建系统发育进化树，检测组织表达特性．为进一步克隆出松江鲈MyoD全长cDNA及深入研究其对肌肉生长发育的作用机理奠定基础．

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验所用松江鲈采自苏州市长江水产繁育工程研究中心．活鱼宰杀后取松江鲈肌肉、肝脏、心脏、肾脏、脑、肠6种组织，液氮速冻后于－80℃储存备用．

1.2 松江鲈总RNA的提取

采用RNAiso（TAKARA，大连）分别提取上述组织的总RNA，用NanoDrop2000（Thermo scientific，USA）测定提取的总RNA的浓度，并用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检验RNA质量．

1.3 引物设计与合成

根据鲤鱼等同源物种MyoD基因序列，用Gene Runner 3.05设计引物lyMyoD F1/R1和SjlMyoDF2，并用DNAMAN检验其保守性．引物由上海生工生物工程有限公司合成．引物3′race outer primer/3′raceinnerprimer为TAKARA 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0试剂盒所自带．引物序列见表1．

1.4 RT-PCR、3’RACE

参照TaKaRa反转录试剂盒要求进行RT-PCR，反应程序为：30℃10 min；42℃30 min；94℃5 min；5℃5 min．以肌肉总RNA反转录所得的cDNA为模板，用引物lyMyoD F1和lyMyoD R1进行PCR扩增．反应程序为：94℃变性3 min；94℃30 s；58℃30 s；72℃1 min，35个循环，72℃10 min．扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳（见图1），得到350 bp左右的条带，与预想结果接近．经胶回收后连接到pMD18-T载体中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取阳性菌液PCR验证，由上海生工生物工程有限公司测序，将测序得到的序列在NCBI上进行Blast，确定为松江鲈MyoD基因部分序列．

再以松江鲈肌肉总RNA为模板，经反转录获得连有3′-RACE Adaptor的cDNA．用引物lyMyoD F1/3′race outer primer进行第一轮PCR扩增，再用引物Sjl MyoD F2/3′race inner primer以第一轮的扩增产物为模板进行巢式PCR．扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳，得到900 bp左右的条带．同上经胶回收、连接、转化及测序，确定为松江鲈MyoD基因3’端序列．

1.5 不同组织mRNA表达分析

运用半定量RT-PCR方法检测不同组织mRNA的表达规律：反转录按TaKaRa反转录试剂盒（TaKaRa RNA PCR Kit Ver.3.0）要求进行（同上述1.3）．RT-PCR时，松江鲈MyoD基因引物lyMyoDF1/R1分别设计在不同的外显子上，以β-肌动蛋白基因（β-actin）为内参照．PCR扩增条件：95℃变性5 min；95℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，25个循环（β-actin基因）或35个循环（MyoD基因）；72℃延伸10 min．用1%的琼脂糖凝胶电泳检测基因的表达量．

表1 本研究所用引物

1.6 统计分析及软件

通过DNAMAN 5.0软件将上述获得的两个片段进行拼接，再用该软件将所得序列翻译成氨基酸序列，用DNAMAN软件和ClustalX1.83软件与其他物种进行比对，利用MEGA 4.1软件构建系统发生树．通过自引导检验（bootstrap）获得系统分支的置信度（重复次数为1000）．

2 结果与分析

2.1 松江鲈MyoD基因部分cDNA和氨基酸序列分析

通过RT-PCR和3′-RACE的方法扩增得到松江鲈MyoD基因部分CDS区及3-′UTR区（见图1，2），克隆测序后拼接得到957 bp的MyoD部分序列（见图3）．分析表明，该段序列可编码188个氨基酸残基，终止密码子为TAG，3-′UTR区长390 bp，含有一个AATAAA加尾信号．

图1 松江鲈MyoD基因中间片段PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳图（1号位）

图2 松江鲈MyoD基因3’-RACE-PCR产物的1%琼脂糖凝胶电泳图（2号位）

2.2 松江鲈MyoD基因部分氨基酸片段与其他物种同源性比较

用DNAMAN软件将得到的MyoD基因的部分序列进行分析，共编码188个氨基酸残基（见图3）．将松江鲈MyoD部分氨基酸片段与其他物种MyoD氨基酸进行比较，发现其与奥尼罗非鱼（Oreochromis aureus）同源性最高，为66.14%．与其他物种同源性分别为：斑马鱼（Danio rerio）61.17%，虹鳟鱼（Oncorhynchus mykiss）58.73%，非洲爪蛙（Xenopuslaevis）56.91%，牛（Bos taurus）53.47%，人（Homo Sapi⁃ens）52.48%，大鼠（Rattus norvegicus）52.74%，小鼠（Mus musculus）51.74%．

2.3 MyoG的系统发育分析

图3 松江鲈MyoD基因部分cDNA序列及氨基酸序列

利用MEGA 4.1软件将松江鲈MyoD推断出的氨基酸序列与人、牛、大鼠、小鼠、斑鳜等16个物种进行比对并构建进化树（见图4）．结果显示，鸟类、哺乳类和鱼类分别形成三个大的分支．在鱼类中，松江鲈MyoD与奥尼罗非鱼的关系最近，松江鲈MyoD首先与奥尼罗非鱼聚集成簇后，又同红鳍东方鲀聚在一起，说明其与奥尼罗非鱼亲缘关系最近，并具有很高的置信度．而与点带石斑鱼（Epinephelus coioides）、斑鳜（Siniper⁃ca scherzeri）及鳜鱼（Siniperca chuatsi）的MyoD距离较远，说明与它们亲缘关系较远．

2.4 松江鲈MyoD基因的组织表达分析

采用半定量RT-PCR方法，β-actin作为内参照，检测MyoD基因在松江鲈肌肉、肝脏、心脏、肾脏、脑、肠6种组织中的表达情况（见图5）．通过PCR优化条件分别选择MyoD基因和β-actin基因在扩增进入平台期前的循环数为35次和25次．结果表明，在松江鲈各种组织中均检测到MyoD基因mRNA的表达，在心脏中表达量最高，在其他几种组织中差异不大．

图4 不同物种推导的MyoD氨基酸序列构建的NJ树

图5 松江鲈不同组织MyoD的RT-PCR检测结果

3 讨论

本实验克隆了松江鲈cDNA部分序列，共957 bp，编码188个氨基酸残基．将该氨基酸序列与小鼠、奥尼罗非鱼等8个物种进行比对，发现同源性较低，为51.74%～66.14%．其中奥尼罗非鱼同源性最高，但也仅为66.14%．可能是由于本实验仅获得了松江鲈MyoD基因部分序列，而未获得全长cDNA序列，而此段序列恰恰与其他物种同源性不高．

松江鲈MyoD基因属于MRF基因家族的一员，含有一个保守的中央蛋白基序，大小为80个氨基酸，称为碱性螺旋-环-螺旋（bHLH），bHLH高度保守．其中bHLH本身可形成α-螺旋二聚体和四聚体．在MRF分子结构中，bHLH本身可形成α-螺旋二聚体和四聚体，但只有二聚体可与DNA结合，且二聚体的4个螺旋必须以平行方向排列，每个区域单独存在均不能有效地激发生肌作用[9-10]．碱性区的Arg111、Ala114、Thr115、Lysl24是激活肌肉基因转录的关键，取代掉这些氨基酸，可以使MyoD及其家族基因调控转录作用丧失，但不会影响其与DNA结合[11]．采用半定量方法进行组织表达分析，在6种组织中均检测到MyoD基因，在心脏中的表达量尤其高，说明MyoD可能对松江鲈心肌细胞的形成和分化有一定作用．

[1]Rawls A,Valdez M R,Zhang W,et al.Overlapping functions of myogenic bHLH genes MRF4 and MyoD revealed in double mutant mice[J].Development,1998,125(13):2349-2358.

[2]Braun T,Arnold H H.The four human muscle regulatory helix-loop-helix proteins Myf3-Myf6 exhibit similar hetero-dimerization and DNA binding properties[J].Nucleic Acids Res,1991,19:5645-5651.

[3]Codina M,Bian Y H,Gutierrez J,et al.Cloning and characterization of myogenin from seabream(Sparus aurata)and analysis of promoter muscle specificity[J].Comp Biochem Physiol Part D,2008(3):128-139.

[4]Hans H A,Thomas B.The role of Myf-5 in somitogenesis and the development of skeletal muscles in vertebrates[J].Journal of Cell Science,1993,104:957-960.

[5]于凌云，白俊杰，叶星，等.大口黑鲈MyoD cDNA的克隆和序列分析[J].生物技术通报，2008，增刊：301-305.

[6]邵炳绪，唐子英，孙帼荚，等.松江鲈鱼繁殖习性的调查研究[J].水产学报，1980，4（1）：8l-88.

[7]潘连德，蔡飞，马召腾，等.中国境内松江鲈鱼的种群特征以及资源保护[J].水产科技情报，2010，37（5）：211-214.

[8]王金秋，潘连德，梁天红，等.松江鲈鱼（Trachidermus fasciatus）胚胎发育的初步观察[J].复旦大学学报（自然科学版），2004，43（2）：250-254.

[9]严婷婷，邵芳，王野，等.赤眼鳟Myf5基因的克隆、序列和表达分析[J].常熟理工学院学报，2011，25（8）：71-75.

[10]苏艳红，王瑞元，周越.运动与生肌调节因子研究进展[J].中国运动医学杂志，2007，26（6）：770-773.

[11]王立新，白俊杰，叶星，等.草鱼MyoD cDNA的克隆和序列分析[J].中国农业科学，2005，38（10）：2134-2138.

Identification and Characterization of Partial cDNA Sequence of MyoD Gene in Trachidermus fasciatus

CAI Bao-ping,LI Feng-ming,ZHENG Hong-mei,YANG Lei,SHAO Fang,LU Xiang-yun,GU Zhi-liang
(School of Biology and Food Engineering,Changshu Institute of Technology,Changshu 215500,China)

Myogenic determination gene is an important member of the myogenic regulation factors(MRF)family, which plays an important role in the specific gene transcription.A 957 bp long MyoD cDNA sequence in Trachider⁃mus fasciatus was obtained by using RT-PCR and 3′-RACE method,which included a 390 bp 3′-UTR,and par⁃tial ORF 567bp encoding 188 amino acid peptide.MyoG gene expression was detected in all six examined tissues, and highly expressed in heart.It suggested that the MyoD gene might contribute to a wide range of biological func⁃tions.

Trachidermus fasciatus;MyoD;3′-RACE;tissue expressional pattern

S917. 4；Q38

A

1008-2794（2012）04-0052-05

2012-03-09

2011年江苏省大学生实践创新训练计划项目“松江鲈肌肉调节因子基因克隆和表达特征研究”；常熟市科技项目“松江鲈种质资源的保存和优质基因的发掘利用”（CN201111）

蔡宝平（1989—），女，江苏新沂人，2009级生物工程专业学生．

顾志良（1968—），男，江苏常熟人，教授，博士，研究方向：动物分子遗传学，E-mail:zhilianggu88@hotmail.com.