眼附属器淋巴增生性疾病的衣原体免疫荧光检测及其意义

杨立军，肖利华，黑 砚，康 莉

(1.辽宁医学院北京武警总医院研究生培养基地，北京 100039；

2.北京武警总医院眼眶病研究所，北京100039)

眼附属器淋巴增生性病变包括反应性增生、不典型增生和淋巴瘤，其中多种淋巴瘤均可发生在此部位，包括胃黏膜相关淋巴组织(mucosa associated lymphoid tissue ，MALT)淋巴瘤、弥漫大B淋巴瘤、浆细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤及小细胞淋巴瘤等[1-2]。临床上，单纯根据患者的临床表现很难区分，主要还是依靠病理诊断，免疫组化和分子生物学技术的发展有助于进一步明确诊断。目前这类疾病发病的诱因尚不清楚，有研究显示：在眼附属器淋巴增生性病变组织中可见慢性炎症的存在，在组织学及临床表现等方面，慢性结膜炎与眼附属器淋巴增生性病变也存在着很多的重叠性，提示某些病原微生物感染或自身免疫性疾病所引起的炎症可能在眼附属器淋巴增生性病变发生中发挥着重要作用。本文作者旨在通过分析原发性眼附属器淋巴增生性病变与衣原体感染的关联性，为其病因及发病机制的研究提供线索和依据。

1 资料与方法

1.1 病理标本实验组：2003年2月—2011年12月在本院手术的常见眼附属器淋巴增生性疾病共118例，其中反应性增生41例，MALT淋巴瘤46例，其他类型淋巴瘤31例。入选标准：症状、体征、影像学检查考虑为淋巴增生性疾病，病理学检查证实诊断，患者及家属签署知情同意书及手术治疗同意书。排除标准：病理结果不明确，存在全身系统性感染者。对照组：2003年2月—2011年12月在本院手术的眼附属器非淋巴增生性疾病标本20例，其中脉管瘤17例，甲状腺相关眼病3例。入选标准：经病理学证实诊断标本内有大量淋巴组织，标本保存完好。

1.2 主要试剂及仪器衣原体特异诊断试剂盒(军事医学科学院生物检验中心)。PBS缓冲液：取PBS缓冲盐(0.01 mol·L-1，北方同正生物技术发展公司)加三蒸水至2 000 mL，充分摇匀，调pH至7.2，过滤除菌，保存备用。试剂盒提供缓冲浓缩母液(应用时每2 mL母液加1 000 mL蒸馏水，NaCl 8.5 g，吐温-80 0.5 mL，即为冲洗缓冲液)。无水乙醇(天津红岩化学试剂厂)。LEICA TP1020组织石蜡自动包埋机；LEICA RM2145切片机；BMJ-A型病理组织包埋冷冻台和PHY-Ⅲ病理组织漂烘仪(常州市中威电子仪器有限公司)；LEICA DMLB光学显微镜；LDZ4-0.8离心机(北京医用离心机厂)；电热恒温培养箱(湖北省黄石恒丰医疗器械有限公司)；

1.3 病理标本的制作将病理标本脱水、浸蜡，常规石蜡包埋，切片，置于载玻片上。常规的二甲苯脱蜡，梯度酒精浸泡，自来水冲洗2 min，PBS液冲洗2 min，过氧化氢10 min，蒸馏水冲洗2 min，加抗衣原体荧光标记的单克隆抗体，使其覆盖标本，放入湿盒中，置37℃浴箱30 min。 以冲洗缓冲液冲洗，甩干，滴加缓冲甘油，加盖玻片封片，于荧光显微镜下观察。

1.4 单克隆抗体免疫荧光法检测标准在每个高倍镜下(×1 000)观察到圆形亮绿色颗粒，大小一致、数量上在10个以上即报告为衣原体包涵体，记为阳性；不足10个或者未见者记为阴性。

1.5 统计学分析采用用SPSS 17.0版软件进行统计学处理，衣原体感染阳性率组间比较采用χ2检验。

2 结 果

实验组118例患者中，淋巴组织反应性增生41例，衣原体感染阳性26 例；MALT淋巴瘤46例，衣原体感染阳性36 例；其他类型淋巴瘤31例，衣原体感染阳性18 例[其中弥漫大B细胞淋巴瘤10例，衣原体感染阳性7例；B细胞淋巴瘤(无法进一步分型)10例，衣原体感染阳性5例；浆细胞瘤4例，衣原体感染阳性 3例；伯基特淋巴瘤2例，衣原体感染阳性 1例；小淋巴细胞淋巴瘤4例，衣原体感染阳性2 例；白血病1例，衣原体感染阳性 0例]。免疫荧光染色结果见图1(封三)。

实验组118例患者中，衣原体感染阳性80例(67.79%)，对照组20例患者均未检出衣原体感染(0%)，衣原体感染阳性率组间比较差异有统计学意义(χ2= 32.262，P<0.001)。实验组中MALT淋巴瘤与淋巴组织反应性增生的衣原体感染阳性率分别为78.26%(36/46)和63.41%(26/41),组间比较差异无统计学意义(χ2=2.333,P>0.05)。非MALT淋巴瘤衣原体感染阳性率为58.06%(18/31)，与MALT淋巴瘤组(78.26%)比较差异无统计学意义(χ2=3.606，P>0.05)。

3 讨 论

眼附属器淋巴增生性病变是眼眶占位性病变中最常见的病变之一，占成人眼眶病的50%。淋巴增生性病变包括淋巴组织反应性增生、淋巴组织不典型增生和淋巴瘤三大部分。在1994年REAL分类正式分出MALT型淋巴瘤之前，因缺少免疫表型的支持，MALT淋巴瘤和反应性增生两者常常混淆，特别是将一些有滤泡样结构的组织划归为反应性增生。有研究[3]报道：单纯通过形态学区分反应性增生与MALT型淋巴瘤的比例为5∶1。通过免疫组化技术鉴别发现反应性增生、淋巴瘤和非典型增生所百分比分别为27%、70%及3%，反应性增生和淋巴瘤的比例明显倒置[4]。近期报道反应性增生比例更低，仅占12%[5]。这可能与病例的筛选等因素有关，但也反应了对淋巴瘤的认识和诊断技术水平的提高。对于诊断不明确，只能套予非典型增生的病例，已从过去的10%以上下降到5%以下[6]。

目前关于淋巴增生性疾病特别是MALT淋巴瘤发病机制的研究，主要集中在病原体感染方面。其中研究最多的是胃MALT淋巴瘤与幽门螺杆菌(helicobacter pylori，Hp)感染的关系。研究[7]发现：约80%胃MALT淋巴瘤中可检测出Hp，并且体内肿瘤生长的快慢与Hp存在与否密切相关；根除Hp治疗可使75%的胃MALT淋巴瘤不同程度消退，早期淋巴瘤可完全治愈。此外还发现：皮肤的MALT淋巴瘤可能与包柔氏疏螺旋体感染有一定关联，小肠MALT淋巴瘤与空肠弯曲菌感染有关，丙型肝炎病毒与脾边缘带淋巴瘤的发生具有关联性[8]。以上证据表明：感染病原体是淋巴瘤发生发展的危险因素，长期慢性感染所导致的持续抗原刺激可能通过多种途径参与了肿瘤的发生。

近几年，国内外学者对眼眶MALT淋巴瘤与感染的关系做了一系列相关研究，感染因素包括幽门螺杆菌、腺病毒及衣原体等，关注最多的是衣原体感染。以前的研究[9-14]认为：有性传播倾向的沙眼衣原体与眼附属器炎症性疾病有关，目前发现鹦鹉热衣原体和肺炎衣原体也与之有关。Decaudin等[15]认为:眼附属器淋巴增生性疾病的发生与慢性感染或自身免疫性疾病有关。

本组结果表明：眼附属器淋巴增生性病变患者组织中衣原体感染阳性率明显高于对照组，尤其MALT淋巴瘤、反应性淋巴细胞增生衣原体感染率较高，因此眼附属器淋巴增生性病变的发病可能和衣原体感染有关。对衣原体感染在眼附属器淋巴增生性病变发病中作用的探讨不仅能明确病因，同时也为该类疾病的治疗提供了一条新的思路。今后可依循眼附属器淋巴增生性疾病与衣原体感染的关联性方向对许多问题进行研究，如明确衣原体感染存在于细胞内的机制、感染与免疫系统的关系等，进一步推动该类疾病发病机制的研究。

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