椎间盘退变的分子机制研究现状

张威林，王海强，陈宇飞，刘志恒，张泳照，万中元，孙 振，罗卓荆

腰痛为骨科的常见病、多发病，脊柱领域的权威杂志《Spine》在1996 将腰痛列为关系人类健康的世纪难题——80%的人一生中至少经历1 次腰痛［1］。据保守估计，美国每年用于腰痛的医疗支出约900亿美元。腰痛因其巨额的医疗支出引发经济压力而成为重要的科学问题、临床问题，乃至社会问题。腰痛的主要原因为椎间盘退变，这是一系列脊柱退行性疾病的病理基础。椎间盘退变为体内外多种因素综合作用的结果，但是其确切的机制尚未明确。本文将对椎间盘退变的分子机制研究进展作一综述。

1 正常椎间盘

1.1 正常椎间盘的结构

椎间盘由位于中心的髓核、外周的纤维环以及上下的软骨终板构成，髓核呈胶冻样，位于中心，纤维环主要由15～25 层定向排列的胶原纤维片层按同心圆的方式排列组成。同一层的胶原纤维互相平行，每层胶原纤维与椎体纵轴成60°角，且任意相邻片层的胶原纤维排列方向都是相反的。软骨终板位于椎间盘与椎体的衔接处，厚度通常＜1 mm，在维持椎体正常形态及椎间盘的营养供应方面发挥着重要作用。椎间盘的核心结构为髓核，对于其整体结构和力学传导功能至关重要，因而，椎间盘退变的研究大多集中于对髓核的研究。髓核内细胞数约为4 000 /mm3，纤维环内约为9 000 /mm3，整个椎间盘的细胞数仅占总体积的1%［2］。纤维环与髓核的主要分成如下：髓核主要由髓核细胞及细胞外基质构成，髓核细胞主要由小而圆的类软骨细胞及大而不规则的脊索细胞构成。细胞外基质主要包括水、Ⅱ型胶原、蛋白多糖，以及少量的细胞外基质成分，包括纤粘连蛋白、纤调蛋白和基膜聚糖等［2］; 由髓核到纤维环，从内向外逐渐由Ⅱ型胶原向Ⅰ型胶原转变，其细胞也由类软骨细胞向类成纤维细胞转化。正因为髓核细胞数量少，而且需要维持大量的细胞外基质，所以椎间盘容易发生退变。

1.2 椎间盘的营养供应

椎间盘的退变与其营养供应的缺乏是密不可分的。椎间盘是人体最大的无血管组织，成人椎间盘髓核几乎无血管，仅在边缘1～2 mm 有小毛细血管。研究发现椎间盘也需要消耗能量，主要是通过糖酵解来供能，椎间盘细胞消耗固定量的氧气、产生少量的CO2，无氧条件下椎间盘细胞也可以存活至少14 d，表明椎间盘组织处于缺血缺氧的状态［3］。椎间盘内pH 值一般为6.9～7.2，在退变的情况下，可以达到6.1［3］。Grunhagen 等［4］发现椎间盘的血液供应主要来自终板的扩散，极少量来自周围的小血管。所以大部分脊柱侧凸的患者由于终板的钙化引起的椎间盘血供受阻，进而导致退化，更加有力的证明了这一观点［5］。

1.3 脊索细胞

成人髓核中以小而圆的类软骨细胞为主(一般所讲的髓核细胞即指这类细胞)，而在幼儿及某些其他物种中以大而不规则的脊索细胞为主［6］。脊索细胞在胎儿出生之后有维护和保持胎儿脊柱功能的作用［7］。脊索细胞在10 岁左右消失，并由软骨样细胞所取代［8］，这与椎间盘刚开始发生退变的时间比较接近。但是，目前有大量的证据可以表明脊索细胞的功能在成人状态依然保存［9］。目前基本可以确定脊索细胞能减少炎症介质在纤维环中的表达［10］，抑制髓核细胞的凋亡［11］，促使细胞外基质增加，起到维持椎间盘正常形态的作用。髓核细胞由于表达FasL 而具有一定的免疫功能［12］，这项发现对于椎间盘的退变和功能的恢复研究具有一定的意义。

2 椎间盘退变的病理变化

2.1 细胞簇的形成

在椎间盘退变过程中髓核细胞的病理改变是目前研究的重点，髓核细胞在退变中的主要特征为标志性的细胞簇形成［13］，其形成的确切机制及转归不明。但目前有很多关于细胞簇形成的假说。有学者通过瘦素在体外刺激大鼠的髓核细胞使髓核细胞大量增殖并形成细胞簇，而且还使用瘦素导致纤维软骨的增生［14］，进而得出瘦素是产生细胞簇的主要原因;还有学者认为细胞簇的形成与一些病理学相关的细胞应激蛋白表达有关，例如应激蛋白HSF-1，Hsp27 和Hsp72［15］。他们认为细胞簇的形成是髓核细胞对于外界刺激的应激反应表现。Jones 等［16］研究发现，髓核是具有吞噬功能的细胞，而且Wang等［17］捕捉到了正在吞噬微粒的髓核细胞的图像，证明髓核细胞具有吞噬作用，所以细胞簇的形成也可能是髓核细胞聚集成簇吞噬坏死凋亡细胞而形成。有研究发现细胞簇主要由衰老、增殖及凋亡的细胞组成［18］。细胞簇的形成是椎间盘退变的标志，所以有关于细胞簇的形成机制值得深入地研究和验证。

对于髓核细胞进行单层培养是研究其生物功能的主要手段之一，而对于单层培养条件下髓核细胞细胞簇的转归问题，文献［17］显示，单层培养的人椎间盘退变的髓核细胞，其细胞簇在培养48 h 后逐渐趋于消失，对探讨细胞簇的成因提供了积极的思路。

2.2 细胞外基质的变化

2.2.1 胶原蛋白的变化

胶原蛋白是构成椎间盘的主要成分，所以在椎间盘退化过程中胶原蛋白的变化不可忽视。构成椎间盘的胶原蛋白主要是Ⅰ型和Ⅱ型胶原，如前所述，正常椎间盘中从内向外逐渐由Ⅱ型胶原向Ⅰ型胶原转变，但是在退变的椎间盘中原本在髓核占主要的Ⅱ型胶原变性，而原本在外层纤维环占主导的Ⅰ型胶原在髓核的表达增加［19］。由于椎间盘中胶原的这种变化会导致椎间盘变硬，传导力的作用降低，使纤维环容易破裂，导致髓核突出压迫神经，出现相应症状。

2.2.2 蛋白多糖的改变

蛋白多糖是一种由多肽为主链、以氨基多糖为侧链组成的大分子。蛋白多糖的改变要比胶原的变化明显，其改变也是椎间盘退化的早期表现之一。在椎间盘退变的过程中，呈聚集状的蛋白多糖含量明显下降，而非聚集的蛋白多糖含量增加，聚集状蛋白多糖的丢失直接导致髓核细胞外基质渗透压下降，从而导致髓核含水量下降，这是引起椎间盘退变并导致其结构和力学性能改变的主要原因［20］。

2.2.3 纤粘连蛋白

纤粘连蛋白可影响细胞的伸展、移动、吞噬、分化及增殖和血液凝固。Anderson 等［21］运用PCR、蛋白印迹和光密度法对正常人和椎间盘退变患者之间纤粘连蛋白的表达进行比较，得出退变椎间盘中纤维连接蛋白基因明显高表达。随着椎间盘退变，纤粘连蛋白含量增加并主要以片段形式存在，可刺激椎间盘细胞产生金属蛋白酶(matrix metal proteinase，MMPs) 和细胞因子，下调蛋白聚糖的含量，增加细胞基质的降解［22］。

2.2.4 MMPs

MMPs 是参与降解全身各种组织的细胞外基质的蛋白酶家族，目前已经发现24 种MMPs，在人类中存在23 种［23］。在胎儿的形成过程中这种酶也起到了十分重要的作用［24］。目前有很多关于MMPs与椎间盘退变之间关系的研究，这些研究主要集中在MMP-1、2、3、7、9、13。有学者在髓核细胞和纤维内环上的观察到MMPs 的表达，而在外环和正常的组织上不表达，在退变的椎间盘髓核细胞中MMPs的表达要高于正常的椎间盘组织［25］。MMPs 组织抑制因子(tissue inhibitors of metalloproteinases，TIMPs) 通过与MMPs 形成稳定复合体及直接抑制MMPs 活化这2 种方式抑制MMPs 以维持其表达稳定［26-27］。一旦失去平衡MMPs 可以使椎间盘丧失原有功能，导致腰疼痛［28］。文献［29］显示，压力负荷可以导致解整链蛋白MMPs 增加，并促进TIMPs-3介导的椎间盘退变的产生。

3 椎间盘退变的分子机制

3.1 FasL-Fas 凋亡途径与椎间盘退变

Fas 是肿瘤坏死因子受体家族成员，FasL 是Fas在体内的天然配体。FasL-Fas 为经典的凋亡传统通路，FasL 在细胞外与细胞膜表面的Fas 结合后，Fas交联成三聚体或多聚体。Fas 分子N-端死亡效应结构域将死亡信号向下传递，活化半胱氨酸天门冬氨酸蛋白酶，降解DNA，导致细胞凋亡［30］。目前有很多关于FasL-Fas 凋亡途径与椎间盘退变的研究。研究表明椎间盘的退变与椎间盘自身的免疫赦免状态的改变有关，组织器官的免疫赦免不仅仅是靠被动的血液生理屏障来维持的，还有FasL 所介导的主动免疫的参与［31］。椎间盘髓核表达FasL，从而可诱导入侵的细胞毒性T 淋巴细胞产生凋亡，而且FasL的表达可以维持T 淋巴细胞和B 淋巴细胞的平衡［32］。在椎间盘形成的早期也有FasL 的表达［33］，从而证明了其对椎间盘免疫稳定性的重要性。所以FasL 的表达对于椎间盘的退变也具有极其重要的意义。研究椎间盘退变状态下FasL 表达的改变，以及髓核细胞和免疫细胞通过FasL-Fas 相互作用机制，对于深入理解椎间盘退变的分子机制有着重要的意义。

3.2 microRNA(miRNA)

3.2.1 miRNA 概述

Lee 等［34］在1993 年第1 次发现了miRNA 为非编码小RNA，长度19～25 nt，广泛存在于真核生物中。它通过与mRNA 的3’非翻译区靶向结合，沉默靶基因或抑制靶基因的表达。在不同物种间具有高度的保守性、时序性和组织特异性。miRNA 与细胞凋亡、细胞癌变、细胞分化、肿瘤转移、病毒感染、细胞增殖等息息相关，近年来关于miRNA 的研究比较热门，2002 年miRbase 收录的miRNA 只有218 条，在2010 年时已经达到15 172 条，目前最新的miRbase18.0 更是增加到了21 643 条。这么众多的miRNA 通过基因调控广泛参与人体的各项生命活动，其在椎间盘退变中发挥什么样的作用值得深入探讨。研究显示椎间盘退变髓核中miRNA 表达谱与相对正常的相比，有29 个miRNA 差异表达，其中上调的6 个，下调的23 个。

3.2.2 miRNA 与椎间盘退变

细胞凋亡主要通过内外2 条通路来激活，内源性通路主要是由线粒体中细胞色素C 等介导，而外源性通路是由死亡受体与其相应的配体结合介导的，其中FasL-Fas 就是这样的外源性通路［35］。研究表明，椎间盘退变中2 种凋亡通路都存在，且与FasL-Fas 介导的细胞凋亡有关。Fas 相关死亡结构域蛋白(Fas-associated protein with death domain，FADD) 及caspase-3 为FasL-Fas 凋亡途径中的关键蛋白，对椎间盘退变时凋亡增多的确切分子机制进行的研究发现miR-155 在退变椎间盘髓核中下调明显［36］，生物信息学分析和报告基因也证实了FADD及CASP3 为miR-155 的靶基因。在体外，上调miR-155 的表达引起FADD 和caspase-3 表达降低，而下调miR-155 的表达则引起FADD 和caspase-3 的增加，进而引起Fas 介导的凋亡增加。从而提出差异表达的miR-155 为椎间盘退变时凋亡增加及椎间盘退变的病因之一。这一发现对于椎间盘退变的分子机制研究具有重要意义。

3.3 炎性介质

大量的研究表明退变的腰椎椎间盘组织中能产生炎性介质，炎性成分已被认为是导致椎间盘退变的主要因素之一。白细胞介素-1(interleukin-1，IL-1) 、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF) 等都已经被证实在椎间盘退变过程中显著增高。IL-1使椎间盘纤维环细胞产生的前列腺素E 和磷脂酶A增加，且分泌呈剂量依赖性，同时能诱导酪蛋白酶mRNA产生，减少纤维环中总的蛋白多糖含量，促进椎间盘退变［37］。TNF 使蛋白聚糖和Ⅱ型胶原基因表达明显下降，诱导椎间盘退变的发生［38］。某些炎性介质在椎间盘的退变过程中也是减少的，例如转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β) ，Pattison 等［39］发现TGF-β1 能够促进髓核细胞分泌蛋白多糖，并可显著降低MMP-2 的活性，TGF-β1 的减少可以引起椎间盘的退变。

4 展 望

综上所述，椎间盘的退变机制错综复杂，对于其退变的机制应该兼顾微观与宏观，而且对于椎间盘退变机制的研究任重而道远，依然存在很多急需解决的问题。对椎间盘退变分子机制的研究，不仅为椎间盘退变的病因提供依据，更为重要的是能够为椎间盘退变的分子治疗提供潜在的新的靶点。例如miR-155 下调为凋亡增加的因素，那么通过病毒介导的pre-miR-155，有可能抑制凋亡而延缓椎间盘的退变，起到治疗作用。椎间盘退变的分子机制尚存很多问题有待进一步研究，希望本综述能给同道带来一些启发，为解决这一困扰人类许久的医学难题指引新的方向。

［1］Waddell G.Low back pain：a twentieth century health care enigma［J］.Spine (Phila Pa 1976) ，1996，21 (24) ：2820-2825.

［2］Raj PP.Intervertebral disc：anatomy-physiology-pathophysiologytreatment［J］.Pain Pract，2008，8(1)：18-44.

［3］Urban JP，Smith S，Fairbank JC.Nutrition of the intervertebral disc［J］.Spine (Phila Pa 1976) ，2004，29(23) ：2700-2709.

［4］Grunhagen T，Wilde G，Soukane DM，et al.Nutrient supply and intervertebral disc metabolism［J］.J Bone Joint Surg Am，2006，88(Suppl 2)：30-35.

［5］Urban MR，Fairbank JC，Etherington PJ，et al.Electrochemical measurement of transport into scoliotic intervertebral discs in vivo using nitrous oxide as a tracer［J］.Spine (Phila Pa 1976) ，2001，26(8) ：984-990.

［6］Roberts S，Evans H，Trivedi J，et al.Histology and pathology of the human intervertebral disc［J］.J Bone Joint Surg Am，2006，88 (Suppl 2) ：10-14.

［7］McCann MR，Tamplin OJ，Rossant J，et al.Tracing notochordderived cells using a Noto-cre mouse：implications for intervertebral disc development［J］.Dis Model Mech，2012，5(1) ：73-82.

［8］于鹏，邵增务.脊索细胞研究进展［J］.国际骨科学杂志，2009，30(4) ：224-225.

［9］Risbud MV，Shapiro IM.Notochordal cells in the adult intervertebral disc：new perspective on an old question［J］.Crit Rev Eukaryot Gene Expr，2011，21(1) ：29-41.

［10］Moon HJ，Joe H，Kwon TH，et al.Notochordal cells influence gene expression of inflammatory mediators of annulus fibrosus cells in proinflammatory cytokines stimulation［J］.J Korean Neurosurg Soc，2010，48(1) ：1-7.

［11］Erwin WM，Islam D，Inman RD，et al.Notochordal cells protect nucleus pulposus cells from degradation and apoptosis：implications for the mechanisms of intervertebral disc degeneration［J］.Arthritis Res Ther，2011，13(6) ：R215.

［12］Geiss A，Larsson K，Rydevik B，et al.Autoimmune properties of nucleus pulposus：an experimental study in pigs［J］.Spine(Phila Pa 1976) ，2007，32(2) ：168-173.

［13］Johnson WE，Eisenstein SM，Roberts S.Cell cluster formation in degenerate lumbar intervertebral discs is associated with increased disc cell proliferation［J］.Connect Tissue Res，2001，42(3) ：197-207.

［14］Zhao CQ，Liu D，Li H，et al.Expression of leptin and its functional receptor on disc cells：contribution to cell proliferation［J］.Spine (Phila Pa 1976) ，2008，33(23) ：E858-864.

［15］Sharp CA，Roberts S，Evans H，et al.Disc cell clusters in pathological human intervertebral discs are associated with increased stress protein immunostaining［J］.Eur Spine J，2009，18(11) ：1587-1594.

［16］Jones P，Gardner L，Menage J，et al.Intervertebral disc cells as competent phagocytes in vitro：implications for cell death in disc degeneration［J］.Arthritis Res Ther，2008，10(4) ：R86.

［17］Wang HQ，Yu XD，Liu ZH，et al.Human nucleus pulposus cell cultures and disc degeneration grading systems：comment on the article by Le Maitre et al［J］.Arthritis Rheum，2010，62(1) ：301-302.

［18］Stephan S，Johnson WE，Roberts S.The influence of nutrient supply and cell density on the growth and survival of intervertebral disc cells in 3D culture［J］.Eur Cell Mater，2011，22：97-108.

［19］Schollmeier G，Lahr-Eigen R，Lewandrowski KU.Observations on fiber-forming collagens in the anulus fibrosus［J］.Spine(Phila Pa 1976) ，2000，25(21) ：2736-2741.

［20］胡明，张传森.退变椎间盘细胞外基质的改变［J］.局解手术学杂志，2004，13(1) ：55-57.

［21］Anderson DG，Izzo MW，Hall DJ，et al.Comparative gene expression profiling of normal and degenerative discs：analysis of a rabbit annular laceration model［J］.Spine (Phila Pa 1976) ，2002，27(12) ：1291-1296.

［22］Oegema TR Jr，Johnson SL，Aguiar DJ，et al.Fibronectin and its fragments increase with degeneration in the human intervertebral disc［J］.Spine (Phila Pa 1976) ，2000，25(21) ：2742-2747.

［23］沈昌焕，欧云生.基质金属蛋白酶(MMPs) 与椎间盘退变［J］.颈腰痛杂志，2009，30(6) ：543-546.

［24］Rutges JP，Nikkels PG，Oner FC，et al.The presence of extracellular matrix degrading metalloproteinases during fetal development of the intervertebral disc［J］.Eur Spine J，2010，19(8) ：1340-1346.

［25］Le Maitre CL，Freemont AJ，Hoyland JA.Human disc degeneration is associated with increased MMP 7 expression［J］.Biotech Histochem，2006，81(4-6) ：125-131.

［26］Singh RJ，Mason JC，Lidington EA，et al.Cytokine stimulated vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1) ectodomain release is regulated by TIMP-3［J］.Cardiovasc Res，2005，67(1) ：39-49.

［27］Gardner J，Ghorpade A.Tissue inhibitor of metalloproteinase(TIMP)-1：the TIMPed balance of matrix metalloproteinases in the central nervous system［J］.J Neurosci Res，2003，74(6) ：801-806.

［28］Weiler C，Nerlich AG，Zipperer J，et al.2002 SSE Award Competition in Basic Science：expression of major matrix metalloproteinases is associated with intervertebral disc degradation and resorption［J］.Eur Spine J，2002，11(4) ：308-320.

［29］Huang M，Wang HQ，Zhang Q，et al.Alterations of ADAMTSs and TIMP-3 in human nucleus pulposus cells subjected to compressive load：Implications in the pathogenesis of human intervertebral disc degeneration［J］.J Orthop Res，2012，30(2) ：267-273.

［30］Lee HO，Ferguson TA.Biology of FasL［J］.Cytokine Growth Factor Rev，2003，14(3-4) ：325-335.

［31］崔冠宇，赵丹慧，田伟.Fas 及其配体与椎间盘退变关系的研究进展［J］.中国脊柱脊髓杂志，2007，17(3) ：229-232.

［32］Hao Z，Duncan GS，Seagal J，et al.Fas receptor expression in germinal-center B cells is essential for T and B lymphocyte homeostasis［J］.Immunity，2008，29(4) ：615-627.

［33］Inui Y，Nishida K，Doita M，et al.Fas-ligand expression on nucleus pulposus begins in developing embryo［J］.Spine (Phila Pa 1976) ，2004，29(21) ：2365-2369.

［34］Lee RC，Feinbaum RL，Ambros V.The C.elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14［J］.Cell，1993，75(5)：843-854.

［35］Park SM，Peter ME.microRNAs and death receptors［J］.Cytokine Growth Factor Rev，2008，19(3-4) ：303-311.

［36］Wang HQ，Yu XD，Liu ZH，et al.Deregulated miR-155 promotes Fas-mediated apoptosis in human intervertebral disc degeneration by targeting FADD and caspase-3［J］.J Pathol，2011，225(2) ：232-242.

［37］Rannou F，Corvol MT，Hudry C，et al.Sensitivity of anulus fibrosus cells to interleukin 1 beta.Comparison with articular chondrocytes［J］.Spine (Phila Pa 1976) ，2000，25 (1) ：17-23.

［38］Séguin CA，Pilliar RM，Roughley PJ，et al.Tumor necrosis factor-alpha modulates matrix production and catabolism in nucleus pulposus tissue［J］.Spine (Phila Pa 1976) ，2005，30(17) ：1940-1948.

［39］Pattison ST，Melrose J，Ghosh P，et al.Regulation of gelatinase-A (MMP-2) production by ovine intervertebral disc nucleus pulposus cells grown in alginate bead culture by Transforming Growth Factor-beta(1) and insulin like growth factor-I［J］.Cell Biol Int，2001，25(7) ：679-689.