基因工程HBsAg纯化技术的研究进展

潘太健 ，马 瑞 ，曹春来 ，彭 韪 ，孙万邦 ，肖拥军

(1.珠海联邦制药股份有限公司生物研究所，广东 珠海 519041; 2.遵义医学院珠海校区·贵州省免疫学研究生教育创新基地，广东 珠海 519041)

乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)存在3种颗粒形式，分别是Dane颗粒、丝状颗粒和球形颗粒[1]。病毒包膜有S蛋白、Pre-S1蛋白和Pre-S2蛋白3种表面抗原蛋白，分别构成了大蛋白(L，Pre-S1+Pre-S2+S)、中蛋白(M，Pre-S2+S)和主蛋白(S)3种形式[2]，因Pre-S1和Pre-S2易被宿主蛋白酶降解，通常基因工程生产的乙肝疫苗产品主要成分是由约100个S蛋白、糖和脂组成直径约22 nm的球形病毒样颗粒(virus-like Particles，VLPs)，S蛋白病毒样颗粒的免疫原性是S蛋白单体1000倍以上[3]，HBsAg结构复杂，在纯化过程中会受到诸多因素的影响而遭到破坏，免疫原性也随之降低，整个纯化过程的收率只有30%左右。因此，保持HBsAg结构的完整性和理化性质的稳定性是提高收率的关键。在此根据HBsAg的结构大小、相对分子质量、带电性质、疏水性、吸附特性、密度等性质总结了HBsAg在纯化的3个阶段采用的主流纯化技术。

1 蛋白捕获阶段

1．1 等电点沉淀

蛋白质在等电点时，净电荷为零，分子间作用力减弱，颗粒碰撞凝聚而形成沉淀物，可以利用该性质进行蛋白初步分离。Hardy等[4]在大规模生产HBsAg时，将破碎液的pH从8调到4.5，目的蛋白和等电点在4.5左右的杂蛋白及非蛋白脂类被沉下来，除去了溶解于此环境的其他杂蛋白，起到了初步分离的作用。

1．2 微滤

微滤是一项根据不同物质间颗粒大小的差异进行分离的技术，根据蛋白颗粒大小选择适合膜孔径的滤膜和压力进行筛分或截留。2007 年，Ottone 等[5]运用了 0.2 μm 微滤膜除去大量杂蛋白，结合截留相对分子质量为300×103或500×103的超滤膜包进行超滤浓缩目的蛋白。这种三明治式的纯化方法是非常有效的，在更换缓冲液的同时使得蛋白浓缩了5倍，60%的杂蛋白被除去。这也是默克公司的特色纯化技术。

1．3 硫酸铵沉淀

硫酸铵沉淀法可用于从大量破碎液中浓缩和沉淀样品，初步分离蛋白质。Liu等[6]使用20% ～40%饱和度的硫酸铵沉淀毕赤酵母表达的含有HBsAg破碎液30 min，12 500 g离心15 min后，很明显地清除了杂蛋白。但Yuan等[7]考察汉逊酵母表达的HBsAg时，硫酸铵对HBsAg却有较大的影响，硫酸铵浓度为0.4 mol/L时，会引起HBsAg聚集，随着浓度增加，聚集现象更加严重，这会改变HBsAg的结构，从而影响其生物活性。可以看出，不同表达系统生产的HBsAg结构和性质有所差异，要对特定的HBsAg的性质进行个性研究。

1．4 聚乙二醇(PEG)沉淀

PEG沉淀是利用空间位阻破坏生物大分子的水化膜来进行蛋白沉淀的一项技术。张焱等[8]在运用PEG沉淀HBsAg时，对PEG相对分子质量、质量浓度、盐浓度、pH、温度进行了正交试验，优化了工艺，最终采用了 PEG6000，质量浓度为0.12 g/L，pH=9.0，温度为4℃的技术参数，保证了样品澄清，且单步收率高达96.8%。

1．5 硅胶吸附

尽管硅胶吸附的机制各家说法各异，但其对于HBsAg纯化具有以下优点:选择性除去HBsAg形式(单体，二聚体)，吸附成熟二硫键结合的病毒样颗粒;通过调整缓冲液和洗脱液的pH可成功吸附和解吸HBsAg，pH是硅胶吸附中的关键参数。Agraz等[9]运用了Hyflo Super Cell，这是一种非特异性吸附硅胶，能使HBsAg颗粒和杂蛋白被吸附到Hyflo Super Cell上，调整洗脱液的pH到8.0～8.25，HBsAg颗粒被解吸下来。

2 蛋白中度纯化阶段

2．1 离子交换层析

在重组HBsAg分离纯化应用中，研究者多运用了DEAE阴离子交换柱，但与疏水层析、分子筛过滤联合后，总收率却低于30%，大部分损失在离子交换层析中，故离子交换层析是HBsAg纯化工艺的瓶颈步骤[10]。研究人员已采用各种策略来优化该步骤，发现了PEG具有良好的链状柔顺性，以其作为保护剂，能保护二硫键，促进蛋白结构稳定和单体组装，使得颗粒更均一，接近天然抗原。Zhou等[11]对PEG流动相中的浓度和相对分子质量进行了对比研究，在流动相中加入1%PEG10000，结果收率和纯化程度明显改善，分离效果良好。

2．2 疏水作用层析

疏水层析是根据蛋白质分子的疏水基团和介质基团间的相互作用力不同来实现分离的，根据高盐上样，低盐洗脱的原理，蛋白质活性回收率高。HBsAg是一种疏水性很强的脂蛋白，在流动相加入乙醇或异丙醇才能洗脱出来，Liu等[6]将样品经苯基疏水填料上样后，盐浓度从8.5%减小到0%进行梯度洗脱，结果均没有将目的蛋白洗脱下来，最后还是在含有10%乙醇的磷酸盐缓冲液中洗脱出来，除去了超过90%的杂蛋白，回收率达到81.3%。

2．3 超滤

一般超滤技术在蛋白纯化中起浓缩和脱盐的作用。在HBsAg超滤中，影响蛋白聚集的因素主要是蛋白浓度、相对分子质量和膜孔径大小，电泳结果却显示回流液中只能收到70%～80%的活性HBsAg，说明在超滤过程中HBsAg部分失活，其原因为HBsAg中α-螺旋的降低和γ-转角的升高引起了蛋白的聚集和变性。2006年，Li等[12]运用高效色谱和在线多角度散色仪扫描研究了汉逊酵母HBsAg在超滤前后结构性质的变化，发现超滤过程中蛋白结构发生了变化，有较多的高聚物产生，蛋白聚集的原因为变性蛋白间的部分位点分子间产生连接。针对这一原因，研究人员在超滤中加入保护剂，提高了活性蛋白收率。

2．4 免疫亲和层析

免疫亲和层析是利用HBsAg和抗体特异性结合的特点来纯化蛋白，S蛋白121～137位的α抗原决定族中121～124位对抗原表位的识别最关键，在HBsAg纯化过程中，很多宿主蛋白伴随HBsAg，干扰了其与抗原结合。为了解决此问题，Leyva等[13]在样品中加入0.1%脱氧胆酸钠(NaDoc)，结果其结合效率比没有处理的样品提高了1.5倍，NaDoc的应用提高了抗原抗体识别能力。Gómez等[14]将 CB-HEP1 anti-HBsAg 用溴化氰(CNBr)法偶联在Sepharose CL-4B上进行免疫层析来纯化从硅藻土中解吸下来的HBsAg，并对抗体的偶联密度进行了对比研究，结果工艺优化后，得出最佳单抗偶联密度为3.2 mg MAb/mL。

2．5 硫酸酯纤维素亲和层析

硫酸酯纤维素是近年来应用比较热门的一种亲和填料，哺乳动物细胞产生的病毒包膜上的糖基和硫酸酯纤维素表现出很好的亲和性，其用于纯化HIN5病毒同样取得很好的分离效果[15]。Jung等[16]在研究HBsAg的L蛋白颗粒时，因为Pre的60～61位和139～140位易被降解，在进行硫酸酯纤维素亲和层析之前，对样品进行了37℃保温16 h以上的热处理，这样可以减少目的蛋白的降解，硫酸酯纤维素层析前的热处理运用到HBsAg的S蛋白颗粒纯化中也可能取得良好纯化效果。Zhao等[17]发现热处理可以促进HBsAg颗粒的成熟，将抗原性提高2～3倍。

3 蛋白精纯阶段

凝胶过滤层析是根据物质的相对分子质量大小进行分离的技术，各个组分按相对分子质量的大小从大到小依次流出，从而达到分离的目的，凝胶过滤层析经常用于HBsAg的精纯中，可以去除HBsAg聚集体和突变体。Nirmala[18]在纯化工艺的最后运用了两步凝胶层析，为了使第2次凝胶精纯样品更均一，在第1次凝胶分子筛得到的样品中加入胰蛋白酶，37℃保温处理5 h，结果第2次凝胶层析得到的样品颗粒大小更均一。

4 展望

随着纯化新方法和新技术的不断涌现，HBsAg的纯化也在不断进步，虽然HBsAg纯化技术不断成熟，但是还面临以下问题:HBsAg的颗粒结构在纯化中不均一、稳定，导致HBsAg聚集体和突变体的产生;酵母细胞表达的HBsAg总收率低，在30%左右，主要原因在于离子交换层析是其纯化的瓶颈;纯化收率低，生产成本高，限制了在发展中国家的广泛应用。研究者正在寻找经济有效的方法和技术来解决这些问题，提高产量，降低成本。

目前，没有一个通用的纯化模式来分离纯化不同表达系统表达出来的HBsAg，因此在工作中，针对特定的HBsAg选择适合自身的纯化流程是最关键的。这需要研究HBsAg自身的各种性质，来选择适合特定HBsAg的纯化工艺。相信随着纯化技术的不断更新和工艺的不断改进，会得到更高纯度和收率的HBsAg。

[1]Lee JM，Ahn SH.Quantification of HBsAg:basic virology for clinical practice[J].World J Gastroenterol，2011，17(3):283-289.

[2]Nirmala B.Expression in and purification of Hepatitis B surface antigen(S-protein)from methylotrophic yeast Pichia pastoris[J].Anaerobe，2006，12(4):194-203.

[3]Milhiet PE，Dosset P，Godefroy C，et al.Nanoscale topography of hepatitis B antigen particles by atomic force microscopy[J].Biochimie，2011，93(2):254-259.

[4]Hardy E，Martínez E，Diago D，et al.Large-scale production of recombinant hepatitis B surface antigen from Pichia pastoris[J].Journal of biotechnology，2000，77(2-3):157-167.

[5]Ottone S，Nguyen X，Bazin J，et al.Expression of hepatitis B surface antigen major subtypes in Pichia pastoris and purification for in vitro diagnosis[J].Protein Expression and Purification，2007，56(2):177-188.

[6]Liu R，Lin Q，Sun Y，et al.Expression，purification，and characterization of hepatitis B virus surface antigens(HBsAg)in yeast Pichia Pastoris[J].Appl Biochem Biotechnol，2009，158(2):432-444.

[7]Yuan H，Li Y，Huang Y，et al.Effects of solvent environment on the structure of hepatitis B surface antigen(HBsAg)[J].Chinese Journal of Biotechnology，2010，26(12):1 674.

[8]张 焱，闭静秀，周卫斌，等.PEG沉淀结合层析分离重组乙肝病毒表面抗原[J].过程工程学报，2006，6(1):100-103.

[9]Agraz A，Quiñones Y，Exposito N，et al.Adsorption-desorption of recombinant hepatitis B surface antigen(r-HBsAg)from P.pastoris on a diatomaceous earth matrix:Optimization of parameters for purification[J].Biotechnology and Bioengineering，1993，42(10):1 238-1 244.

[10]Huang Y，Bi J，Zhang Y，et al.A highly efficient integrated chromatographic procedure for the purification of recombinant hepatitis B surface antigen from Hansenula polymorpha[J].Protein Expression and Purification，2007，56(2):301-310.

[11]Zhou W，Bi J，Janson JC，et al.Ion-exchange chromatography of hepatitis B virus surface antigen from a recombinant Chinese hamster ovary cell line[J].J Chromatogr A，2005，1 095(1-2):119-125.

[12]Li Y，Bi J，Zhou W，et al.Characterization of the large size aggregation of Hepatitis B virus surface antigen(HBsAg)formed in ultrafiltration process[J].Process Biochemistry，2007，42(3):315-319.

[13]Leyva A，Sánchez JC，Valdes R，et al.A combinatorial strategy of a new monoclonal ELISA and immunoaffinity chromatography using sodium deoxycholate to increase the recovery of multimeric proteins like r-HB-sAg[J].Talanta，2010，81(1-2):314-319.

[14]Gómez L，Hernandez R，Ibarra N，et al.Comparison of different ligand densities for the manufacture of CB Hep-1 immunosorbents[J].J Biochem Biophys Methods，2002，52(3):151-159.

[15]He C，Yang Z and Tong K.Downstream processing of Vero cell-derived human influenza A virus(H1N1)grown in serum-free medium[J].Journal of Chromatography A，2011，1 218(31):5 279-5 285.

[16]Jung J，Iijima M，Yoshimoto N，et al.Efficient and rapid purification of drug-and gene-carrying bio-nanocapsules，hepatitis B virus surface antigen L particles，from Saccharomyces cerevisiae[J].Protein Expression and Purification，2011，78(2):149-155.

[17]Zhao Q，Towne V，Brown M，et al.In-depth process understanding of RECOMBIVAX HB？maturation and potential epitope improvements withredox treatment:Multifaceted biochemical and immunochemical characterization[J].Vaccine，2011，29(45):7 936-7 941.

[18]Nirmala B.Expression in and purification of Hepatitis B surface antigen(S-protein)from methylotrophic yeast Pichia pastoris[J].Anaerobe，2006，12(4):194-203.