不同表达载体对玉米抗蚜虫基因转化效率的影响

裴东明，杜光玲，李海霞，进茜宁，汤继华，胡彦民，周警疆

(1.河南农业大学农学院，河南 郑州450002;2.英国洛桑研究所，英国，哈彭登AL52JQ)

玉米作为转基因技术主要的研究对象受到世界各国科学家的广泛关注，应用转基因技术已经从玉米中获得了可用的农艺性状［1］.目前，虽然已有从原生质［2］、丛生芽［3］、悬浮细胞［4］、幼胚［5］等中获得转化成功的报道，但从整体的转化情况看，用幼胚经过诱导获得的胚性愈伤组织是最好的农杆菌转化及植株再生的受体材料.但由于玉米胚性愈伤组织诱导能力对基因型依赖性很强［6］，生产上常用自交系的胚性愈伤组织诱导率不高，严重制约着玉米遗传转化效率.国内对玉米蚜虫的研究内容主要局限于防治技术方面，在生物学及生态学方面的研究仅是对玉米蚜虫的发生规律进行了简单的观察记载.而国外从蚜虫的生物学特性、寄主对蚜虫繁殖的影响、危害玉米蚜虫的种类、环境变化对蚜虫繁殖的影响等方面进行了系统而全面的研究.大量研究结果表明，蚜虫报警信息素的主要成分是［反］-β-法尼烯(Eβf).英国洛桑研究所从薄荷中克隆了［反］-β-法尼烯(Eβf)合成酶基因，并将其转化到拟南芥中［7］，发现该基因的导入可以明显降低蚜虫对拟南芥的危害，说明了Eβf合成酶基因在植物抗蚜虫方面的利用价值，为玉米抗蚜虫转基因的工作开辟了新途径.目前，玉米遗传转化体系研究大多集中在单因素对遗传转化率的分析上，包括自交系筛选、受体材料、培养基调适、载体系统优化、辅助转化、筛选标记及标记剔出等，尽管也获得了一些有关玉米产量、品质及抗性(抗虫、抗病、抗寒和抗旱等)［8，9］性状改良的研究结果，但转化率总体上不高，离实用性基因工程平台技术的要求还有相当的差距.所以本试验旨在通过探索基因型、转化载体等多因素对遗传转化效率的影响，以获得较为理想的转化体系.

1 材料与方法

1.1 材料

以自交系87-1和郑22，杂交种87-1×郑22、郑22×87-1、郑 58×HiⅡA 和昌7-2×HiⅡA为材料.农杆菌菌株为LBA4404.

1.2 培养基

诱导培养基:N6+2.0 mg·L-12，4-D+500 mg·L-1脯氨酸 +500 mg·L-1水解酪蛋白 +30 g·L-1蔗糖.

继代培养基:N6+2.0 mg·L-12，4-D+700 mg·L-1脯氨酸 +500 mg·L-1水解酪蛋白 +30 g·L-1蔗糖.

再生培养基:N6+1.0 mg·L-1KT+1.0 mg·L-16-BA+700 mg·L-1脯氨酸 +700 mg·L-1水解酪蛋白+30 g·L-1蔗糖.

共培养培养基:N6+2.0 mg·L-12，4-D+700 mg·L-1脯氨酸+500 mg·L-1水解酪蛋白+30 g·L-1蔗糖 +100 μmol·L-1AS，pH=5.8.

延迟培养基:N6+2.0 mg·L-12，4-D+700 mg·L-1脯氨酸 +500 mg·L-1水解酪蛋白 +30 g·L-1蔗糖 +300 mg·L-1Cef，pH=5.8.

筛选培养基:N6+2.0 mg·L-12，4-D+700 mg·L-1脯氨酸 +500 mg·L-1水解酪蛋白 +30 g·L-1蔗糖 +200 mg·L-1Cef+20 mg·L-1G418，pH 值 =5.8.

再生培养基:N6+1.0 mg·L-1KT+1.0 mg·L-16-BA+700 mg·L-1脯氨酸 +700 mg·L-1水解酪蛋白 +30 g·L-1蔗糖 +100 mg·L-1Cef，pH=5.8.

1.3 方法

1.3.1 愈伤组织的诱导和继代 取人工套袋授粉10～14 d不同基因型的玉米幼雌穗，将其剥去苞叶，用体积分数70%乙醇浸泡1～2 min，在无菌条件下取出，并用无菌水冲洗3遍，用解剖刀切除子粒顶部，取长度约1～2 mm幼胚，接种在诱导培养基上.每个基因型根据材料的多少重复20～30皿.在黑暗、26℃条件下进行愈伤组织诱导.将诱导出的优良胚性愈伤组织用镊子夹成大小均匀一致的小块，每皿放入25～30块愈伤组织，转入新鲜培养基中继代14 d.

1.3.2 受体材料的预培养 转化前3 d，挑选生长一致的继代培养的优良愈伤组织转接1次，进行转化前预培养，以使愈伤组织具有最旺盛的生命力，以最好的状态接受农杆菌侵染.

1.3.3 表达载体的构建 本试验所用抗蚜虫基因EβF cds序列全长为1 652 bp.用限制性核酸内切酶NotI从中间载体pART7-EβF(由英国洛桑研究所馈赠)上切下抗蚜虫基因EβF片段(约3 800 bp)，将其定向连接在经相同酶切的过渡质粒载体pNMCS上，构建成过渡载体pNMCS-EβF;再用限制性核酸内切酶PacI和AscI分别酶切构建好的过渡载体pNMCSEβF和携带有 Cre/loxp重组系统的质粒载体pNCX，将切下的EβF片段(约4 000 bp)定向连接到经双酶切后的pNCX中，构建成含Cre/loxp重组系统的表达载体 pNCX-EβF(图1).另一表达载体pBJ40-EβF由英国洛桑研究所馈赠(图2).

图1 表达载体pNCX-EβF的构建Fig.1 The construction of expression vector pNCX-EβF

1.3.4 表达载体转入农杆菌 (1)挑取农杆菌LBA4404单菌落置于3 mL液体YEP培养基(含100 mg·L-1lRif和 50 mg·L-1Str)，28 ℃，200 r·min-1振荡过夜培养.

图2 表达载体pBJ40-EβFFig.2 The expression vector pBJ40-EβF

(2)以1∶200接种于50 mL是YEP培养基中，28 ℃，200 r·min-1摇菌至 0.5，冰浴 10 min.

(3)5 000 r·min-1，4℃离心10 min后弃上清液，收集菌体.

(4)弃去上清液，加入10 mL冰预冷的双蒸水，吸打混合均匀，用双蒸水调体积500 mL，混合均匀.再分别用250和50 mL双蒸水重复(3)，(4)步骤2次.

(5)5 000 r·min-1，4℃离心10 min后弃上清液，用5 mL 10%预冷无菌甘油重悬菌体.

(6)以50 μL为单位分装于1.5 mL无菌离心管中，液氮速冻，-80℃保存备用.

(7)取50 μL农杆菌感受态置于冰上融化，加入 1 μL构建好的质粒 pNCX-EBF(或 pBJ40-EβF)，轻轻混匀.

(8)将混合物转入冰预冷的电击杯中.

(9)用Bio-Rad细胞融合仪进行电击.Capacitance:25 Uf;Voltage:2.4 kV;Tesistance:2 000 hm;Plus length:5 ms.

(10)电击后菌体立即加入1 mL YEP培养基(不含抗生素)，28 ℃，200 r·min-1振荡培养4～6 h.

(11)4 000 r·min-1，离心5 min，弃上清液，收集菌体，涂布于含有相应抗生素(50 mg·L-1Kan，50 mg·L-1Str，100 mg·L-1Rif或 50 mg·L-1Sp，50 mg·L-1Str，100 mg·L-1Rif)的固体培养基平板上，28℃倒置培养3 d左右.

(12)挑取平板上长出的单菌落，接种于含相应抗生素的培养基中，28℃，180 r·min-1振荡培养，菌液PCR扩增鉴定.将鉴定正确菌液取700 μL加入1.5 mL灭菌离心管中，再加入50%的灭菌甘油300 μL混匀，液氮速冻，-80℃保存备用，近期使用也可以-20℃短期保存.

1.3.5 农杆菌的侵染和筛选 将预培养3 d的愈伤组织，转化前将愈伤组织夹入三角瓶中，尽量不要带培养基，倒入已准备好的农杆菌侵染液(N6+AS，pH 值 =5.2，OD 值为 0.3 左右)，完全浸没愈伤组织.轻轻摇动数次后，静止5～10 min，侵染完成，弃去菌液，用滤纸将愈伤组织吸干后置于含100 μmol·L-1乙酰丁香酮(AS)的继代培养基上，25℃下避光共培养3 d.然后将玉米愈伤组织用无菌水冲洗2～3次，再用含有300 mg·L-1头孢霉素(Cefotaxime，简写为Cef)的清洗液清洗1次，放于滤纸上吸干.转入加有200 mg·L-1Cef的继代培养基中，25℃暗培养7 d.再转入加有Cef 100 mg·L-1和相应抗生素的培养基上进行避光筛选，每代15 d，连续筛选2代，筛选完后转入再生培养基进行植株再生.

2 结果与分析

2.1 玉米受体材料的选择

2.1.1 不同玉米基因型愈伤组织出愈率的差异

由于基因型的差异，幼胚的出愈率不尽相同(表1).从表1可以看出，杂交种87-1×郑22和郑22×87-1都有较高的出愈率和胚性愈伤率，87-1和郑58×HiⅡA出愈率相对较高，但胚性愈伤率却是较低，郑22和昌7-2×HiⅡA出愈率不足90%，和其它几种基因型的比较处于中上等水平，胚性愈伤率在50%，也是一般水平.

2.1.2 不同玉米基因型愈伤组织表型的差异 愈伤组织的划分一般参照AMSTRONG等［10］的标准:具有再生能力的愈伤组织根据生长状况和再生途径分为2类，即I型愈伤组织和II型愈伤组织.I型愈伤组织白色块状、坚硬、干燥、结构紧密，难以长期继代培养，主要通过器官发生途径再生植株;II型愈伤组织乳白色或浅黄色、结构松散易碎、呈颗粒状、易产生胚状体，适合长期继代培养，主要通过胚状体途径再生植株，是理想的愈伤组织类型.后来根据不同试验者的观察又把结构松软、白色透明或半透明，水渍状，不容易继代培养，且丧失了分化能力、不能再生成苗的愈伤组织划分Ⅲ型.

从表2可以看出，由于基因型的差异，诱导出来的愈伤组织形态也表现出了很大的区别.87-1、郑22诱导出来的愈伤组织块硬，属于I型愈伤，继代能力差，再生率低;87-1×郑22、郑22×87-1的愈伤组织色泽发黄，属于Ⅱ型愈伤组织，两者几乎没有差别;郑58×HiⅡA诱导的愈伤组织块硬且干燥，不适合继代，明显不如87-1×郑22和郑22×87-1的愈伤组织;昌7-2×HiⅡA的愈伤组织十分松散，呈明显的米黄色颗粒状，属于较好的Ⅱ型愈伤组织.就杂交种而言，昌7-2×HiⅡA的愈伤组织最好，87-1×郑22和郑22×87-1的愈伤组织次之，郑58×HiⅡA的愈伤组织较差.

表1 不同基因型愈伤组织的诱导结果Table 1 The induction results of calli from different genotypes

表2 脱分化愈伤组织的生长状况Table 2 The callus growth situation of dedifferentiation

2.1.3 不同玉米基因型愈伤组织繁殖能力的差异

诱导出来的愈伤组织进行继代培养，各基因型的繁殖能力不同，使得愈伤组织的生长量差异也很明显.表3显示，基因型不同，愈伤组织的繁殖能力存在差异.自交系的繁殖能力普遍很弱，而杂交种中昌7-2×HiⅡA的繁殖继代能力最强，明显高于其他3个杂交种，这与昌7-2×HiⅡA的愈伤组织形态有很大的关系，昌7-2×HiⅡA的愈伤组织松散湿润，呈明显的米黄色颗粒状，非常适合继代.试验中发现昌7-2×HiⅡA的愈伤组织的繁殖继代能力会逐渐增强，继代几次后愈伤组织的色泽更加鲜亮、松散，状态更好.

表3 不同基因型繁殖能力的比较Table 3 The comparison of reproductive capacity of different genotypes

综合上述分析，昌7-2×HiⅡA为较好的愈伤组织培养材料.因此，下面的试验将以昌7-2×HiⅡA的愈伤组织为转化受体进行转化效率的研究.

2.2 不同玉米表达载体对转化效率的影响

通过以上步骤将携带有抗蚜虫基因EβF的2个不同表达载体pNCX和pBJ40分别侵染玉米昌7-2×HiⅡA的愈伤组织，对抗性愈伤组织进行检测后，进行植株再生，结果如表4.以pBJ40为载体转化愈伤组织1 000块，得到了65块抗性愈伤组织，5棵再生苗;而以pNCX为载体转化愈伤组织1 000块，筛选后得到了620块抗性愈伤组织，130棵再生苗.试验中还发现，经G418筛选后发现以pBJ40为载体的愈伤组织在筛选中愈伤组织迅速变褐变暗，且水渍现象严重，以pNCX为载体筛选时愈伤组织较鲜黄、干燥.因此，无论是从筛选中的状态、筛选后的块数，还是最终的再生苗数，都说明以pNCX为载体比以pBJ40为载体转化效果好.

表4 不同玉米表达载体对目的基因转化效率的影响Table 4 The influence of different expression vector on conversion efficiency of target gene

3 结论与讨论

基因型是玉米组织培养过程中的一个重要因素，愈伤组织的质量状态是影响愈伤继代的关键.付凤玲等［11］研究指出，各种基因型之间愈伤组织诱导率差异较大.魏开发等［12］对玉米幼胚诱导愈伤组织的研究表明，基因型不同幼胚的发育情况不同，胚性愈伤组织诱导概率存在很大差异，自交系的可诱导性是可以遗传的，即自交系的诱导概率高，其杂交后代也较容易诱导产生愈伤组织.有些材料虽然诱导出了愈伤组织，但继代过程中逐渐褐化死亡，无法继代下去.在试验中还发现，足够黑暗的条件下有利于愈伤组织的生长，愈伤组织表现为健壮、色泽鲜黄.暗度不够时，愈伤组织容易转成硬块状，失去颗粒结构，向I型愈伤组织转变.刚诱导出的愈伤组织比较坚硬，经过3或4次继代后，愈伤组织生长旺盛，色泽鲜亮，增殖快，是进行基因转化的最好时期.

通过对各种基因型玉米幼胚的诱导以及愈伤组织的继代，可以看出不同基因型的出愈率不同，愈伤组织的质量和状态不同.杂交种的出愈率明显高于自交系.试验数据显示，杂交种87-1×郑22，郑22×87-1和昌7-2×HiⅡA的出愈率和继代繁殖能力都很优越，是良好的组织培养材料，昌7-2×HiⅡA的培养优势尤为明显.

本试验说明，以昌7-2×HiⅡA的愈伤组织为转化受体，用农杆菌介导法转化抗蚜虫基因，以抗生素G418作为筛选剂时，从筛选时愈伤组织的生长状态、筛选后所得到抗性愈伤的块数及得到的再生苗数来看，表达载体pNCX的转化效率明显高于表达载体pBJ40.

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