多氯联苯对鱼肝功能的影响、机制及防治

2012-04-13许友卿计沈斌丁兆坤

饲料工业 2012年12期

许友卿计沈斌丁兆坤

(广西大学水产科学研究所，广西南宁530021)

多氯联苯（PCBs）是联苯的氢原子被一个或一个以上氯原子取代后形成的氯代烃类化合物，目前发现有209种PCBs同分异构体，分为二噁英类PCBs和非二噁英类PCBs。其中二噁英类PCBs的毒性较强。PCBs作为典型的持久性有机污染物，它几乎不会燃烧、不易被热分解、不易被氧化、不溶于水、不易导电，又抗强酸、强碱，是一种相当稳定的绝缘体。PCBs具有亲脂性强、难分解、远距离迁移等特点，是斯德哥尔摩公约中优先控制的12类高毒化学品之一。虽然许多国家在数十年前就已经禁止生产和使用，但被土壤中有机质、污泥和沉积物所吸收的PCBs还在不断地污染环境，并通过食物链积累危害鱼等水生动物、人和其他动物体。

PCBs的高致毒性、高残留性和难降解性引起了全人类的关注，当前关于PCBs的研究已经在其环境行为、环境安全评价及其环境毒理等多方面展开，并在PCBs迁移与吸附、对生物免疫、生殖、雌/雄激素、甲状腺激素等系统的干扰、致畸、致癌作用及机理的研究取得了一定进展。

鱼类尤其是幼鱼对PCBs非常敏感，是水体PCBs主要毒害的对象，而肝是生物体新陈代谢和解毒的主要器官。以前对PCBs毒性的研究多以小鼠为对象，对鱼类的毒性效应和致毒机理研究较少，对其肝功能影响的研究更少，因此，亟需研究。

本文重点综述PCBs对鱼类肝功能的影响及机理研究进展，同时总结了目前预防PCBs对鱼类影响的一些措施，旨在更好地理解PCBs对鱼类肝功能的毒性效应、机理和预防，为水环境包括海洋环境评估、管理和保护提供科学参考。

1 PCBs的毒性效应

1.1 PCBs的来源及危害

PCBs主要源于人为废物排放和泄漏、化工冶金工业、杀虫剂的生产、垃圾焚烧、堆肥等。

PCBs可通过皮肤、呼吸道、消化道等途径进入鱼、人和其他动物体，并可与血脂结合，运输到身体各个部位，包括肝脏、甲状腺、免疫系统、生殖器官及大脑等，然后积累起来。

PCBs毒性主要表现为：①致精卵畸形，引起生育缺陷；②影响钙代谢，损害骨骼和牙齿；③影响大脑、皮肤、神经、肝脏；④致癌，如肝癌和胆管癌等；⑤降低免疫力。例如，雌性成鱼暴露在PCBs后，卵巢中成熟卵泡数量减少，卵泡闭塞，受精卵数量和质量下降，孵化率降低，胚胎缩短，导致一系列生长发育问题。Lauriano等(2012)把海鲤(Sparus aurata)暴露于PCB126,发现海鲤除血管充血外，还出现红细胞溢出、淋巴球渗透及肥大细胞持续增加的现象。

PCBs对动物的毒害是时间-剂量依赖型。鲫鱼(Carassius auratu)肝中7-乙氧基-异吩唑酮-脱乙基酶(7-Ethoxyresorufin-O-deethylase，EROD)的活性被PCBs诱导激活，酶活性在一定范围内随PCBs浓度增加而增强，也随着暴露时间延长而增强。Grimes等在不同时间用PCB126处理斑马鱼(Brachydanio rerio)胚胎，发现受精24 h后暴露在PCB126的斑马鱼的胚胎所孵化的鱼与对照组略有形态差异，极个别出现轻微的心包膜积液；48 h后暴露胚胎所孵化的鱼心包膜积液显著,心脏明显畸形；72 h后暴露胚胎所孵化的鱼心脏较小，心房被挤到心室尾部；96 h后暴露胚胎所孵化的鱼心包膜积液极其严重,心脏进一步缩小。把大西洋鲟鱼(Acipenser oxyrinchus oxyrinchus)暴露于PCB126中,当剂量为0.01 μg/kg时,胚胎细胞色素P450IA(cytochrome P450、P450、CYP1A)被诱导增加6.5倍；当剂量为0.1 μg/kg时,胚胎CYP1A增加到82倍；当剂量为100 μg/kg时，胚胎CYP1A达到120倍。

1.2 PCBs对鱼类肝功能的影响及机理

长期生活在含PCBs水中的鱼肝细胞出现严重坏死，胞核萎缩或肥大，大多数受损肝细胞是因为染色体结构改变而致细胞凋亡。可见PCBs对肝影响很大。

1.2.1 肝细胞色素P450

细胞色素P450(P450)是一类亚铁血红素-硫醇盐蛋白的超家族，主要分布在内质网和线粒体内膜上，是一种末端加氧酶。PCBs对P450有显著的诱导作用，因为PCBs的代谢主要是在P450酶作用下进行的。An等发现，从受到PCBs污染的水域中收集的红眼鲱鲤(Liza haematocheila)肝内CYP1A表达量显著提升。虹鳟(Oncorhynchus mykiss)经PCB126暴露后，诱导肝CYP1B1、CYP1C1和CYP1C2分别增加8倍、17倍和4倍，CYP1A增加110～200倍，比斑马鱼和鳉鱼(Fundulus heteroclitus)多增加约15倍。鱼体内的CYP1A、CYP1B、CYP1C基因表达模式可以成为环境监测芳香烃受体（AHR）激活剂和抑制剂的生物标志物。Gao等发现，PCB126强烈诱导棘鱼(Gasterosteus aculeatus)肝CYP1Cs，他们把棘鱼暴露于PCB126 24 h，转入清水养殖24 h之后，测得棘鱼肝CYP1A、CYP1B1、CYP1C1和CYP1C2表达量分别为对照组的52、7、103、68倍，可见棘鱼肝CYP1Cs对PCB126非常敏感，而且差别很大。正常情况下，P450 mRNA表达量很低，PCBs对这些基因的强烈诱导主要是因为PCBs暴露激活了AHR途径。

1.2.2 肝7-乙氧基-异吩唑酮-脱乙基酶

7-乙氧基-异吩唑酮-脱乙基酶(7-ethoxyresonfin-0-deethylase.EROD)是鱼肝中的混合功能氧化酶，经PCBs暴露后其活性显著提高。一方面，生活在PCBs污染水域的金鱼（Carassius auratus）肝EROD活性与PCBs含量正相关。Spearow等对条纹鲈(Morone saxitilis)研究发现，EROD活性的提高与CYP1A含量增加是一致的。Lemaire等报道，把大西洋鲑(Salmo salar)暴露于PCB126之后,CYP1A表达水平和EROD活性都显著提高。另一方面，大嘴黑鲈(Micropterus salmoides)经PCB126暴露后，肝的EROD活性以时间依赖型升高。所以，EROD活性已经被用作检测肝中毒的生物标志物。

然而，Parente等发现，对钩鲶(Ancistrus)和甲鲶(Corydoras)注射或暴露PCB126后，两种鱼肝微粒体内的EROD活性均被显著诱导，而对翼甲鲶(Pterygoplichthys)注射或暴露PCB126，其EROD均变化不大，这可能是显性基因控制的缘故，使EROD不易被表达或表达后不具活性。

1.2.3 活性氧分子、丙二醛和抗氧化酶

活性氧分子(reactive oxygen species,ROS)是指含氧的自由基，包括羟自由基(·OH)，超氧阴离子(O2-)，单线态氧(O2)及过氧化氢(H2O2)等。ROS具有很强的氧化力，当机体内产生过多ROS又不能及时清除时，就会引起脂质过氧化反应，首先是多不饱和脂肪酸与自由基相互作用形成脂质自由基L·，L·被氧化成为LOO·，后者又与其他多不饱和脂肪酸反应，重复上述过程，形成链式反应，最终形成丙二醛(malondialdehyde，MDA)。

PCBs除了增加ROS的含量外，还增加抗氧化酶消耗量和降低抗氧化酶缓解ROS的能力。超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)已经被提议作为环境监测计划的生物标志物。CAT和硒依赖型谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性与PCB浓度呈负相关。PCB126能抑制肝CAT活性，进而降低肝清除H2O2的能力，而且还诱导降低GPX和谷胱甘肽转移酶(GST)活性。Wu等在对褐葛鲍(Sebasticus marmoratus)的研究中发现，经PCB77处理后，鲍体内GPX活性显著下降。但是也

有研究发现，当对日本青鳉（Oryzias latipes）进行PCBs

处理后，其肝脏GPX活性有显著的提高，且编码GPX的基因表达量也显著增加，这可能是动物对毒性反应自我调节的结果。

Ferreira等报道，水体PCBs诱导鳍鱼（Mugil cephalus）和欧川鲽(Platichthys flesus)体内的氧化胁迫反应，检测到肝MDA含量及氧化损伤程度与水体污染物浓度呈正相关。

脂质的过氧化应激反应也是PCBs致毒的重要途径之一。机体暴露于PCBs后，诱导体内CPY450酶活性，加速了生物体内部的氧化反应，产生的ROS破坏大分子结构，使其丧失功能，而且它还能通过链式反应将自由基从一个大分子传递到另一个大分子上，导致细胞结构大范围损坏，从而引起细胞凋亡；脂质过氧化反应产生的MDA能进一步致碱基损伤，DNA断裂，最终导致细胞内脂肪代谢异常，细胞组织破坏和凋亡。这是PCBs的主要毒理之一，它降低抗氧化酶的活性，引起脂质过氧化反应，产生过多的ROS和MDA而影响机体的正常运作。

1.2.4 糖代谢

肝脏是肝糖原代谢的主要器官。PCBs能上调机体基因在糖酵解、糖异生、柠檬酸循环等方面的作用。Nault等（2012）报道，给虹鳟注射低浓度PCBs就能显著增加葡萄糖在体内的转运。有人发现，从受PCBs污染的江河中收集的小嘴鲈鱼(Micropterus dolomieu)肝内糖原被耗竭。对禁食红点鲑(Salvelinus alpinus)投喂溶有Aroclor1254的鱼油，肝糖原含量降低。然而，Nakayama等发现，对日本青鳉投喂含PCB126饲料后，葡萄糖的含量增加，而糖原水平并没有明显的下降，说明其增加葡萄糖的主要途径是糖异生而不是糖酵解，同时发现糖酵解的改变很可能是由于基因变异的结果，PCBs暴露后通过糖异生的途径来维持葡萄糖的含量。这可能是PCBs刺激了外源物质代谢酶的表达，加速了能量消耗。

糖原的消耗一般是应激反应的结果，也就是说在应激反应下,鱼类的糖分解会大大增加。不过，Kraemer等却发现，对底鳉(Fundulus heteroclitus)暴露PCB77后，降低了一些与糖酵解有关的酶活性。Sanchez等用PCB126处理大嘴黑鲈，也发现两种肝糖分解酶(烯醇酶3和果糖二磷酸醛缩酶B)表达量下降。对虹鳟暴露PCBs后，其肝糖原含量下降，肝内乳酸脱氢酶活性显著增强，而己糖激酶活性则明显降低。这些糖分解酶活性降低和糖异生酶活性增强，可能都是因为AHR途径的反应介导作用。

1.2.5 ATP与ATPase

PCBs不仅能破坏糖代谢，而且也能破坏动物体的膜功能。ATPase是一种复合膜结合物，能通过跨膜质子通道控制质子流，驱动ATP合成。PCBs等有毒物质作为一种解偶联剂，并不阻止有氧呼吸电子传递链的进行，但是阻碍了ATPase合成ATP，使能量以热能形式散发。房展强等报道，PCBs对剑尾鱼(Xiphophorus helleri)暴露之后，肝Na+/K+-ATPase活性随时间延长而降低。Bellehumeur证明对虹鳟暴露于PCB126后，其新陈代谢很旺盛，但合成ATP量却很少。

1.2.6 致癌作用

PCBs诱导某些抑癌基因，如p53、pRB等突变，可能导致某些染色体形态异常，一些细胞由于端粒太短而失去功能，进而凋亡。Senthilkumar等指出，PCBs引起细胞衰老和癌变，是显著抑制端粒酶活性和缩短端粒长度引起的。

细胞角蛋白(CKs)能促进癌上皮细胞形成，而细胞角蛋白17(CK17)抗体在口腔鳞状细胞癌中的表达量很高。Yum等用Aroclor 1260处理日本鳉鱼,发现CK17基因表达量明显上升,因此，CK17基因表达水平可以用作检测环境对硬骨鱼诱癌因子的生物标志物。

改变一些膜联蛋白(A)基因的表达也是肿瘤形成的原因之一，其中A1、A2表达量增加和A10表达量降低都会引发肝癌，这可能与联膜蛋白基因位于染色体的位置有关，联膜蛋白能抵制抗癌药物，间接促进肿瘤的形成，所以联膜蛋白既可以用作检测癌症的标志物，又可作为治疗靶点。

2 AHR与AHR基因

PCBs主要通过激活AHR影响下游功能基因表达而发挥毒性效应。AHR基因经过长时间复制和演化,至少形成3种形式:AHR1、AHR2和AHR受体。AHR是一种配体激活转录因子,PCBs一旦与AHR结合,AHR便开始转移到细胞核，在细胞核中与核AHR转运蛋白(ARNT)结合，激活或抑制核内靶基因表达。

AHR调节基因对AHR激活剂非常敏感，PCBs和AHR通过与AHR激活剂结合，相互作用，诱导激活CYP1A基因表达，并在细胞核内合成一些对外来毒物起氧化代谢作用的酶，产生一些高度致癌性中间产物，最终导致细胞凋亡或癌症。配基诱导AHR靶基因表达和调节染色体改变的关系与配基的毒性有很好的相关性。

不过，并不是所有PCB都是通过AHR途径致毒的，如PCB153与肿瘤坏死因子(TNF)受体结合，通过金属硫蛋白基因家族的参与导致氧化应激，由线粒体途径引起细胞凋亡。还有报道，PCBs通过诱导ROS激活ROCK传递信号，从而加速肿瘤细胞的新陈代谢和转移。

一些长期生活在含PCBs水域中的鱼类对PCBs产生遗传抗性，这可能与AHR基因有关。Wirgin等对大西洋鳕鱼暴露于PCBs后，其体内会出现AHR的变异体AHR2,从而产生PCBs抗性,这可能是因为AHR2与免疫蛋白相互作用,进而稳定和提高AHR结合和转移PCBs能力,使鱼体对PCBs产生抗性。Aluru等对

长期暴露在PCBs下的大西洋青鳉鱼AHR基因进行甲基化处理，发现大西洋青鳉对PCBs产生遗传抗性的原因并不是由于AHR基因启动子的甲基化，也许是青鳉控制AHR基因的组织特异性表达。

3 PCBs的分析测定

检测PCBs的方法很多，常用的主要包括气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、反向高效液相色谱(RP-HPLC)、GC/高分辨率质谱分析(HRMS)、HPLC/光敏二极管阵列法(PDA)等。例如Suutari等用高分辨率GC/HRMS分别从驯鹿和大青鲨体内检测出了37种和17种PCBs同系物，但是测定较耗时。

最近，一些学者在前人的基础上，研究出几种可靠、灵敏、操作简单的检测方法。Gavlasova等发明了一种具有高度选择性的PCB检测器-完整细胞光学生物检测器。Zhuang等报道，用免疫-PCR荧光定量(FQ-IPCR)方法检测PCB77，方法可靠、灵敏、再生性好。Li等报告，一种能微量检测PCBs的方法——原型多孔氧化锌检测器，能检测含量很低的PCBs。Yang等(2010)运用一种小范围内自动集合的微型电解池模型形成纳米银树突，使其展现出非常强的表面增强拉漫光谱(SERS)效应，再用玫瑰精做探针，检测PCBs，测量极限在10-6M左右。Zhu等（2012）进一步在银纳米板组装膜表面加了一层癸硫醇,能更有效地俘获PCBs,测量极限缩小到10-7M。Jin等发明了一种新型多孔阳极氧化铝检测器,最小的检测值能计算到0.12 ng,而且操作简便，检测快速。Dorst等（2011）用噬菌体取代抗体作为识别元素检测PCBs,最小解离常数能达到10-6M水平，是非常有应用前景的生物检测器。

然而，目前检测PCBs的流程仍然复杂，而且仪器昂贵。发展更有效率、方便、经济的检测器，快速检测PCBs，还任重而道远。

4 预防PCBs对鱼类的影响。

4.1 减少饲料中的有机污染物

减少或防止饲料中的有机污染物，可预防PCBs对鱼类的直接影响。Torstensen等认为，鱼饲料是鱼类养殖中持久性有机物的主要污染源，而且高脂肪(鱼油)含量可能有协同作用。用活性碳可以净化鱼油中73%的DL-PCBs。用蒸汽去除法、短程蒸馏法或逆流超临界CO2萃取法等都能有效净化鱼油中PCBs等有机污染物。Bell等（2012）用植物油饲喂大西洋鲑，发现其体内PCBs等有机污染物含量明显低于用鱼油饲喂者。

4.2 修复受PCBs污染的水体

对PCBs污染的水体进行修复是减少PCBs对鱼类影响最直接的方法。降解PCBs的方法很多，分为生物降解和非生物降解。非生物降解包括物理降解和化学降解，利用PCBs的亲脂性，表面活性剂等也能达到修复PCBs污染的效果。但是非生物降解比较昂贵，还容易造成二次污染，因为它在降解过程中容易产生更有毒性的副产物（如TCDD等）。生物降解主要包括植物修复、微生物修复和植物-微生物修复3方面。Jia等首次分离了一株降解PCBs能力较强的革兰氏阴性菌LY402，在有氧条件下，它既可以降解高氯PCBs，也能降解低氯PCBs。厌氧菌和好氧菌共同作用能增加PCBs降解的范围和速度。此外，植物转基因也为生物降解PCBs提供了新的方法。Arnoldsson等（2012）报道，PCBs等有机污染物的代谢途径是依靠卤素取代模式进行的，一旦卤素被取代了，其毒性就会大大的降低。这也是控制PCBs污染的一种有效方法。

4.3 增强鱼体本身的抵抗力

给鱼投喂含植物油、VA、VE、VC等微量营养素的饲料，可以降低有机污染物的毒害，增强抵抗力。VE、VC具有维持正常视觉、上皮细胞分化、胚胎发育、抗氧化、抗肿瘤及增强免疫等功能。PCBs能阻碍VA在肝脏内的储存，促进其排泄，导致血清中的维生素A明显降低。虽然PCBs会降低VE含量，但是VE能降低PCB126的毒性作用。多不饱和脂肪酸（PUFAs）具有增强鱼类免疫能力的功能，因此适当添加PUFAs可以增强鱼类的存活率。Lai等（2011）研究发现，食物中适当添加硒也能降低PCB126的毒性作用。因此，适当补充微量营养素对降低PCBs的毒性，保护水产动物免受或少受PCBs毒害是有积极意义的。