不同胎牛血清、培养瓶体外培养大鼠骨髓间充质干细胞效果比较

何丁文，邬亚华，殷 明，魏强强，殷嫦嫦

(1南昌大学第二附属医院，南昌330006;2九江学院)

骨髓间充质干细胞(BMSCs)是来源于中胚层的具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞之一，不仅可分化成中胚层来源的多种细胞，如骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞等，且可分化成内皮细胞［1］、神经细胞［2］及内胚层来源的细胞［3］，此外BMSCs具有特殊的免疫逃避及抑制特性［4］，可用于异体移植，随着干细胞治疗临床应用的兴起，BMSCs已成为重要种子细胞来源，在临床可用于创伤后神经修复、软骨损伤修复、细胞替代治疗等，是最具临床应用前景的干细胞之一。体外获取、分离及纯化BMSCs是干细胞治疗的关键环节。2012年1～3月，我们比较了普通、高纯度胎牛血清培养基及塑料瓶、玻璃瓶体外培养全骨髓贴壁法分离的骨髓间充质干细胞的效果，旨在建立一种简便、有效、稳定的BMSCs分离培养体系。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 健康4周龄SD大鼠6只，雌雄不限，由南昌大学动物科学部提供，实验过程中对动物的处置符合2006年科技部《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。

1.1.2 主要试剂和仪器设备 DMEM、0.25%胰蛋白酶－EDTA消化液、标准胎牛血清、PBS粉、DMSO (Solarbio公司)，DMEM/F12(HyClone公司)，高纯度胎牛血清(GIBCO公司，南美产)，一次性塑料培养瓶(CORNING公司)，CO2恒温孵育箱(SIM公司)，超净工作台(苏州净化设备有限公司)，倒置相差显微镜及照相系统(NIKON公司)。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs分离培养 将健康4周龄SD大鼠乙醚麻醉后颈椎脱臼法处死，75%乙醇浸泡10 min，将SD大鼠转入超净台内，无菌条件下取双侧股骨、胫骨、肱骨、尺桡骨，彻底清除附着其上的肌肉组织，去除两端骨骺，暴露骨髓腔，5 mL无菌注射器抽取PBS液反复冲洗骨髓腔至骨髓腔变白，吹打离散细胞，将冲洗液收集于离心管中，1000 r/min离心5 min，弃去上清及脂肪，加入含10%FBS的DMEM培养液6～7 mL，重悬细胞种植于100 mL培养瓶中，37℃、5%CO2、饱和湿度下培养，3 d后首次更换培养液，去除未贴壁细胞，以后每3 d换液1次，第7～10天传代。

1.2.2 BMSCs传代及纯化 倒置显微镜下观察待贴壁细胞融合达90%时，用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液消化贴壁细胞，镜下观察见细胞变圆且部分脱落时加入等量培养液终止消化，吸管反复吹打，液体转移至无菌离心管中，1 000 r/min离心5 min，弃去上清夜，培养液5～6 mL重悬成单细胞悬液，按1∶2或1∶3传代，细胞随着换液和传代逐渐纯化。

1.2.3 BMSCs分组培养及培养效果观察 分为4组。其中2组分别采用含10%标准胎牛血清的DMEM培养基、含10%高纯度胎牛血清的DMEM/ F12培养基培养，分别为标准胎牛血清组和高纯度胎牛血清组。2组分别用一次性塑料瓶和玻璃瓶培养，分别为塑料瓶组和玻璃瓶组。培养过程中采用倒置显微镜在100倍视野下观察并比较比较标准胎牛血清组合高纯度胎牛血清组、塑料瓶组和玻璃瓶组BMSCs的黏附、增殖、分化状况及细胞形态。

2 结果

标准胎牛血清组细胞原代培养第3天全量换液后见少量贴壁变形细胞，部分细胞呈短梭形，透亮度较高，轮廓清晰，但细胞增殖缓慢，第7天细胞密度仍低，出现异常分化、衰老现象，部分细胞脱落，细胞透亮，出现多个突起，类似神经样细胞，增殖至第10天细胞面积仍只占瓶底面积的50%左右，传代后细胞几无增殖，呈现瘢痕样及神经球样细胞形态;高纯度胎牛血清组细胞原代培养第3天全量换液后见贴壁细胞较多，部分细胞呈短梭形，逐渐呈长梭形，轮廓清晰，细胞增殖较快，细胞形态大致一致，第7天见细胞呈典型的长梭形，细胞呈栅栏样、鱼群及漩涡样集落生长，细胞间紧密排列，第9天铺满瓶底达80%左右，未出现异常分化、衰老细胞，传代细胞经1～2 d静止期后呈对数增长，4 d左右铺满瓶底达90%左右，细胞形态呈一致的典型的长梭形，紧密排列。

塑料培养瓶组细胞贴壁、变形较快，4 h左右基本贴壁完成，贴壁后细胞增殖速度较快，呈典型形态生长，换液时未出现脱落现象;玻璃培养瓶组细胞贴壁、变形慢，24 h后仍有部分漂浮细胞，贴壁后细胞增殖速度较慢，细胞形态尚典型，换液时细胞出现部分脱落现象。

3 讨论

间充质干细胞是具有自我更新和多向分化潜能的成体干细胞，其来源及分布广泛，已在脂肪、肝脏、脐血、羊水等组织中分离出间充质干细胞，但目前细胞的获取及研究仍主要集中在骨髓组织，骨髓中间充质干细胞的比例极小，约占骨髓有核细胞的0.0001%～0.001%［5］。BMSCs在不同的体外条件下可诱导分化成成骨细胞、骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、心肌细胞及内皮细胞等，是理想的干细胞治疗的种子细胞。因此寻找一种简便、有效、稳定的BMSCs分离培养及纯化体系具有十分重要的意义。

1966年Friedenstein等［6］首次采用BMSCs的塑料黏附生理习性对其进行分离培养，后人在此基础上对分离方法不断改进，目前常用的BMSCs体外分离、纯化培养方法主要有四种:全骨髓贴壁法、密度梯度离心法、流式细胞仪分选法及免疫磁珠分选法［7］，其中以前两种方法最为常用，全骨髓贴壁法是最早应用的方法，在不断换液及传代过程中可以去除不贴壁的血细胞和造血细胞成分，此种方法操作简便，细胞损伤小，经3～4次传代后可获得纯度较高的BMSCs;密度梯度离心法利用各细胞成分的密度不同采用特定密度的淋巴细胞分离液分离BMSCs，所获得的原代细胞纯度较高，但在3～4次传代后细胞纯度与全骨髓贴壁法无明显区别［8］;流式细胞仪和免疫磁珠分选法可获得纯度较高的BMSCs，但容易损伤细胞，甚至造成细胞失活，限制了这两种方法的应用［9］。本研究采用全骨髓贴壁法分离培养BMSCs，经过多次换液冲洗及传代后得到形态比较一致的典型的纤维样细胞，细胞紧密排列。

BMSCs的鉴定标准为:①细胞呈纤维样细胞形态;②在标准培养条件下，BMSCs必须具备塑料黏附特性;③BMSCs必须表达CD73、CD90、CD105，而不表达CD34、CD45、CD14、CD11b、CD79或者CD19和HLA-DR表面分子;④BMSCs必须能在体外分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞［10，11］。本研究发现高纯度胎牛血清组获得形态大致一致的长梭形纤维样细胞，细胞呈栅栏样、鱼群及漩涡样集落式生长，紧密排列，而且在后面的实验中发现，该细胞在塑料培养瓶中比玻璃培养瓶黏附牢固，结果符合上述标准的前两条，可初步断定我们所获得的细胞为BMSCs，但为获得确实证据需进一步鉴定细胞表面标志物并在体外进行诱导。

BMSCs增殖需多种细胞因子和生长因子共同作用，如PDGF、VEGF、IGF等，但目前仍没有一种细胞因子和生长因子混合物能满足细胞生长需求，故干细胞培养通常在基础培养基中应用胎牛血清作为培养添加剂［12］，本研究中我们采用不同厂家的不同类别的胎牛血清及培养基对BMSCs进行分离培养，以观察不同血清及培养基对干细胞增殖、分化的影响，结果发现标准胎牛血清组不能得到典型的细胞，细胞增殖缓慢，而且细胞老化、分化现象严重，而高纯度胎牛血清组可获得典型的长梭形细胞，细胞增殖活跃，多次换液及传代后获得较纯的细胞，可能因不同血清其纯度、细胞因子和生长因子含量及“隐形成分”不同导致了不同的结果。

综上所述，本实验结果证实了全骨髓贴壁法分离、纯化培养BMSCs可行，为快速获得纯度较高的BMSCs需采用纯度较高的血清及塑料培养瓶，对体外扩增BMSCs用于干细胞治疗有重要意义。

［1］Reyes M，Dudek A，Jahagirdar B，et al.Origin of endothelial progenitors in human postnatal bone marrow［J］.J Clin Invest，2002，109(3):337-346.

［2］Woodbury D，Schwarz EJ，Prockop DJ，et al.Adult rat and human bone marrow stromal cells differentiate into neurons［J］.J Neurosci Res，2000，61(4):364-370.

［3］Sato Y，Araki H，Kato J，et al.Human mesenchymal stem cells xenografted directly to rat liver are differentiated into human hepatocytes without fusion［J］.Blood，2005，106(2):756-763.

［4］Shi M，Liu ZW，Wang FS.Immunomodulatory properties and therapeutic application of mesenchymal stem cells［J］.Clin Exp Immunol，2011，164(1):1-8.

［5］Pittenger MF，Mackay AM，Beck SC，et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells［J］.Science，1999，284 (5411):143-147.

［6］Friedenstein AJ，Piatetzky-Shapiro II，Petrakova KV.Osteogenesis in transplants of bone marrow cells［J］.J Embryol Exp Morphol，1966，16(3):381-390.

［7］贾贵清，张明鸣，杨平，等.不同分离及培养方法对大鼠骨髓间充质干细胞生长增殖和生物学特性的影响［J］.四川大学学报(医学版)，2009，40(4):719-723.

［8］杨丽，张荣华，谢厚杰，等.建立大鼠骨髓间充质干细胞稳定分离培养体系与鉴定［J］.中国组织工程研究与临床康复，2009，13 (6):1064-1068.

［9］马力，刘人军，李德天，等.不同分离方法及培养条件对兔骨髓间充质干细胞生长增殖及生物学特性的影响［J］.中国组织工程研究与临床康复，2008，12(38):7401-7406.

［10］Zhu H，Guo ZK，Jiang XX，et al.A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse compact bone［J］.Nat Protoc，2010，5(3):550-560.

［11］Chen BY，Wang X，Chen LW，et al.Molecular targeting regulation of proliferation and differentiation of the bone marrow-derived mesenchymal stem cells or mesenchymal stromal cells［J］.Curr Drug Targets，2012，13(4):561-571.

［12］McCarty RC，Gronthos S，Zannettino AC，et al.Characterisation and developmental potential of ovine bone marrow derived mesenchymaI stem cells［J］.J Cell Physiol，2009，219(2):324-333.