HSV-1扩增子载体对神经系统疾病治疗作用的研究进展

张 桦，史巧娣

单纯疱疹病毒 1型（herpes simplex virus type-1，HSV-1）具有强神经亲嗜性，已经被广泛的用来构建各种基因转移载体，常见的HSV-1源性基因载体包括条件复制性载体，复制缺陷型载体和HSV-1扩增子载体。HSV-1扩增子载体为不含病毒结构蛋白的假病毒载体，具有以下特点：①装载容量大，可高达150 kb；②宿主细胞广泛，既可感染分裂细胞又可感染非分裂细胞，包括中枢神经系统；③不含编码病毒结构蛋白的基因等优势。这些优势使得HSV-1扩增子载体成为一种十分有力的神经系统疾病基因治疗载体。本文将对HSV-1扩增子载体在神经系统疾病方面的应用作一综述。

1 单纯疱疹病毒概述

单纯疱疹病毒1型属于疱疹病毒家族，该家族包含多种不同的DNA病毒，常见的有以下几种：单纯疱疹病毒2型（herpes simplex virus type-2，HSV-2）， 水痘带状疱疹病毒（varicella zoster，HHV-3），人类巨细胞病毒（human cytomegalovirus，HCMV），卡波济肉瘤相关病毒（Kaposi's sarcomaassociated herpesvirus，KSHV），EB 病毒（Epstein-Barr virus，EBV）[1]。 其中，HSV-1，EVB[2]和 HCMV[3]由于其广泛的细胞亲嗜性和其生物学特性，已经被广泛的用来构建各种基因转移载体，其中，HSV-1相关性载体的发展更为引人注目。

2 HSV-1扩增子载体

HSV-1扩增子由以下元件组成：①包含有细菌复制起始点（如ColE1）的细菌质粒骨架载体；②HSV-1的顺式作用元件复制起始点ori和切割包装信号pac；③外源基因表达盒。在辅助病毒提供结构蛋白的情况下，HSV-1扩增子载体可包装成假型病毒，该假型病毒含有与 HSV-1野生病毒相同的包膜结构，具有与 HSV-1相同的细胞感染亲嗜性，其基因组DNA同样可以以附加体的形式存在于宿主细胞核内。该载体不表达病毒基因组的结构基因，为完全的复制缺陷性载体，其可以以稳定地附加体形式存在于不分裂的细胞。作为一种基因治疗载体，HSV-1扩增子载体的外源基因装载量可高达150 kb，其外源基因既不仅可在分裂细胞中进行表达，也可在不分裂细胞中进行表达。此外，HSV-1扩增子载体不整合至宿主细胞，故其不会因外源基因的插入而导致宿主细胞的突变，从而具有很好的安全性。

3 HSV-1扩增子载体在神经系统疾病治疗方面的应用

3.1 帕金森病 帕金森病（PD）是一种神经退行性疾病，其发病机制与表达多巴胺神经递质的中脑黑质神经元的选择性丢失有关。多巴胺神经递质的减少可导致机体出现运动障碍，包括静止性震颤、运动迟缓、肌强直和姿势步态异常等改变。目前，外源性给予左旋多巴是改善PD症状的最有效的方法。左旋多巴是合成多巴胺的前体，其在内源性多巴胺脱羧酶（aromatic amino acid decarboxylase，AADC）的作用下可转化为多巴胺。然而，左旋多巴长时间应用会导致其失去药效，因此，通过基因治疗使受损细胞的功能得以重建显得尤为重要。目前，已有通过病毒载体，包括HSV-1扩增子载体携带的基因治疗分子应用于受损细胞的功能重建，其中包括携带与多巴胺合成有关的内源性功能酶 （如酪氨酸羟化酶Th和AADC）和对神经细胞具有保护作用的治疗基因，包括胶质细胞源性神经生长因子 （glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF）和脑源性细胞生长因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF)，以保护剩余的多巴胺源性神经元。

近来，Sun及其同事在HSV-1扩增子载体具有高容量的基础上，将与多巴胺生物合成和运输有关的4种基因（Th，AADC，GTP水解酶I，囊状单胺运载体I）在神经组织特异启动子的启动下克隆入HSV-1扩增子载体，随后，通过无辅助病毒污染的包装系统对该扩增子载体的包装，并将其感染至由6-羟基多巴所致的PD动物模型，6个月后，由阿扑吗啡诱导的PD动物的旋转实验得到很好的纠正，同时PD动物体内的多巴胺含量和K依赖的多巴胺的释放量均有明显增加。此外，Sun及其同事将不同的神经生长因子在神经特异启动子的启动下通过扩增子载体介导，即分别表达GDNF和BDNF的 HSV-1扩增子载体和同时表达GDNF和BDNF的HSV-1扩增子载体并通过无辅助病毒污染的载体包装系统进行包装，给予6-羟基多巴所致的PD动物，以比较不同神经生长因子对黑质多巴胺神经元的保护作用和相应受损症状的改善情况[4]。7个月后的实验结果显示，单独给予GDNF较单独给予BDNF和联合给予GDNF和BDNF显示出更好的神经保护作用和症状改善作用[4]。

3.2 缺血性脑损伤 脑卒中、脑供血不足等因素所导致的脑缺血性损伤，可使脑神经元、神经胶质细胞和其它类型细胞的氧和营养物质供应不足。缺氧可导致受损细胞发生一系列级联反应，并最终导致细胞凋亡。HSV-1立即早期启动子（如IE4/5基因启动子）具有快速、高效的启动基因表达的功能，因此，以HSV-1扩增子为载体，以HSV-1立即早期启动子启动抗凋亡因子或神经保护因子以期在最快的时间内表达相关基因，为缺血性脑卒中等所致的脑缺血性损伤的治疗开辟了一条新的道路。Antonawich及其同事夹断蒙古沙鼠双侧颈内动脉建立脑缺血模型，提前24 h将表达Bcl-2（一种抗凋亡分子）的HSV-1扩增子载体（HSVbcl-2)和空HSV-1扩增子载体分别提前给予左侧和右侧海马，结果显示，左侧CA1海马存活神经元较对侧明显增多[5]。Harvey等[6]对神经保护因子GDNF在缺血性脑卒中动物模型中的神经保护作用进行了相关研究。他们提前4 d将携带GDNF的HSV-1扩增子载体给予经夹闭单侧大脑中动脉60 min所致的大鼠缺血性卒中模型的大脑皮层。结果显示，GDNF在对缺血组织的神经保护方面和改善神经受损功能方面均较对照组显示出良好的神经保护作用。相反，对夹闭单侧大脑中动脉所致的大鼠缺血性卒中模型，3 d后给予HSV-1扩增子GDNF载体对缺血组织进行神经保护，结果显示，缺血后给予GDNF未能对缺血组织显示出神经保护功能，充分说明，GDNF对缺血神经元具有保护作用，且该保护作用不是由缺血后神经组织的自我修复所介导的。

此外，除了上述的神经保护基因GDNF之外，通过HSV-1扩增子载体携带的其它一些抗氧化基因如谷胱甘肽过氧化物酶基因（glutathione peroxidase gene，GPX）[7]，超氧化物歧化酶基因（superoxide dismutase，SOD-1)[8]，钙结合蛋白D28K基因[9]，热休克蛋白基因72（heat-shock protein gene，HSP72）和葡萄糖转移酶基因（glucose transporter gene，GLUT）也已广泛的应用于动物的缺血性卒中研究，并展示出了良好的神经保护作用。

3.3 遗传性共济失调 近来，有学者利用 HSV-1扩增子载体携带的治疗基因对遗传性共济失调，包括毛细血管扩张性共济失调症（ataxia-telangiectasia，A-T）和弗里德赖希共济失调症（Friedrich's ataxia，FA)进行了相关研究。毛细血管扩张性共济失调症以神经退行性变，免疫缺陷和自发的肿瘤倾向为临床上表现，有研究报道A-T突变相关基因（ATM）的突变与该疾病的发病机制密切相关[10]。FA共济失调症与frataxin蛋白的功能异常有关，研究显示9号染色体长臂上的frataxin基因1号内含子区域内的GAA三核苷酸重复序列异常扩增可导致frataxin蛋白功能异常[11]。Frataxin蛋白功能缺失可引起脑脊髓的严重退行性变化，从而导致严重的运动系统共济失调症状。Cortes及其同事将携带ATM基因长约9Kb的cDNA通过 HSV-1扩增子载体感染至A-T细胞系，以观察相关细胞表型的改变[12]，同时，该研究小组将此扩增子载体感染至ATM基因缺陷的小鼠（Atm-/-）的小脑神经元，以进行进一步的研究[13]。此外，Cortes及其同事还通过HSV/AAV杂合扩增子载体介导将ATM基因的cDNA定点整合至Atm-/-小鼠的人AAS1位点[14]，然而，将ATM基因整合至Atm-/-小鼠以后，由于Atm-/-小鼠模型所表现的神经退行性方面不能反映出A-T患者的真实症状，使得小鼠并未表现出良好的基因校正功能。目前，基于 HSV-1扩增子载体对FA疾病的治疗研究也有一定的报道。Gomez-Sebastian及其同事在BAC携带的 HSV-1扩增子载体的基础上，将全长135 kb的完整的FRDA基因克隆入该扩增子载体，并将该载体感染至FA患者的原代成纤维细胞以观察其基因校正功能。结果显示：这些细胞在处于氧化应激时可表现出一定的基因恢复功能[15]。此外，Lim及其同事通过cre/loxp定点重组系统产生一种条件性的FD转基因模型，通过将携带cre重组酶的HSV-1扩增子载体输送至转基因小鼠的脑干后cre重组酶对Loxp位点的定点打靶，可使小鼠产生典型的共济失调症状，从而产生一种条件性的FA疾病模型。通过这种条件性的FA小鼠模型，Lim及其同事将携带Frataxin蛋白cDNA的HSV-1扩增子载体输送至上述小鼠脑干部位，结果显示，通过互补性的提供Frataxin至小鼠受损脑干，FA小鼠表现出良好的功能恢复行为。总之，基于HSV-1扩增子载体的这些研究为目前尚无有效治疗方法的A-T和FA的可行性治疗提供了一定的理论基础。

3.4 阿尔茨海默病 阿尔茨海默病是一种进展性神经退行性病变，目前的研究表明，淀粉样蛋白前体蛋白 （amyloidprecursor protein，APP)的异常剪切产物 β-淀粉样多肽1-42（amyloid-β 1-42 amino acid peptide，Aβ1-42） 与该病的发生有密切关系[16]，该发现提示，基于HSV-1扩增子载体的免疫治疗可应用于阿尔茨海默病的治疗。因此，有学者将阻止Aβ产生过程和此后Aβ缠结过程的免疫治疗策略应用于临床前的AD动物模型，结果显示相关策略可很好的阻止该疾病的进展[17]。最初的该方面的相关研究是一项基于辅助疫苗平台的针对Aβ1-42的疫苗，将该疫苗应用于临床前AD动物模型后取得了可喜的临床前试验结果。然而，在随后应用AN-1792 Aβ辅助疫苗的二期临床试验中，部分患者出现了严重的炎症反应[18]。这一结果使开发新的既可以打破患者对自身形成的Aβ的很好的耐受反应，又可以通过表达可以重塑患者体内免疫反应以降低Th2途径介导的有害免疫反应的发生的新型疫苗平台显得更为重要。有学者将携带单独Aβ1-42基因的 HSV-1扩增子载体（HSVAβ）或 Aβ1-42与破伤风毒素片段C融合基因的HSV-1扩增子载体（HSVAβ/TtxFC）给予Tg2576 AD小鼠，结果显示，机体不仅加强了对Aβ的体液免疫反应，而且降低了Aβ在小鼠脑内的沉积[19]。然而，研究结果还显示给予HSVAβ的小鼠海马区域的炎症因子 （如IFN-β，IFN-γ，IL-6和MIP-2） 转录水平的 mRNA量明显增多，这说明脑内不同部位的免疫反应也存在一定的差异。白介素-4（Interleukin-4，IL-4)可引起Th2差异性免疫反应，最近有学者将表达Aβ和IL-4基因的无辅助病毒污染的 HSV-1扩增子（HSVIEAβCMVIL-4）输送至转基因AD小鼠（3xTg-AD)，该转基因小鼠模型与人类阿尔茨海默病的发病机制相似[20]。分别在3xTg-AD小鼠2、3和9月龄时经皮下接种HSVIEAβCMVIL-4和相应的对照质粒，接种HSVIEAβCMVIL-4的小鼠由Th2介导的Aβ1-42的特异性IgG抗体含量明显增加，这说明海马区可很好的呈递沉积的Aβ和磷酸化的Tau蛋白信号，同时，接种HSVIEAβCMVIL-4的小鼠在11月龄时进行迷宫学习和记忆评估的结果均较对照组提高，从而可以更好的说明降低AD的致病途径可以改善AD的临床症状。这些令人兴奋的实验结果为进一步的基于 HSV-1扩增子载体在阿尔茨海默病的治疗中的应用打下基础。

综上所述可见，HSV-1扩增子载体由于其仅含有野生HSV-1基因组的复制起始点ori和包装信号pac，不含编码病毒的结构蛋白，具有很好的安全性，同时其还具有广泛的细胞嗜性，巨大的装载容量，较小的免疫源性和容易操作等优点，已成为一种十分有前景的基因治疗载体，相信HSV-1扩增子载体在今后的日子里将进一步促进神经系统疾病基因治疗的发展。

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