结核病实验室诊断技术进展

杨淑华 综述，张月香 审校

(天津市中心妇产科医院检验科，天津300100)

结核分枝杆菌 (Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的结核病是常见的人类传染病之一。约三分之一的世界人口曾经感染MTB，亚洲地区感染者占全世界的三分之二。据WHO估计，2007年全球约有927万新发结核患者，175万人死于结核病，中国是全球22个结核病高发国之一，发病人数 130万，居世界第2位，仅次于印度[1，2]。结核病的实验室诊断是发现传染源的主要途径和手段，是确定结核病诊断和化疗方案的重要依据，长期以来，结核病的实验室诊断主要依赖细菌学涂片和培养检查。由于方法所限，严重影响了结核病的及时诊断，因此建立检测快速、灵敏度高、特异性强的诊断方法，对于结核病防治工作具有重要意义[3]。现将近年来结核病实验室检测技术的进展综述如下。

1 结核病病原菌检测技术

1.1 抗酸杆菌涂片镜检

1.1.1 萋-尼氏抗酸染色涂片 萋-尼抗酸染色涂片镜检是经典的结核分枝杆菌检测方法，目前很多实验室仍然依靠此方法进行结核检测，但其灵敏度较低，仅20%～30%，而且此方法繁琐，假阳性和假阴性较高。张立群对比了4种不同结核分枝杆菌检测方法，显示萋-尼抗酸染色涂片的阳性率为11.6%，灵敏度仅为26.3%[4]。

1.1.2 荧光染色法 以金胺-罗丹明为代表的荧光染色法提高了镜检的灵敏度，并使读片时间大大缩短，假阳性和假阴性也明显降低[5]。但荧光显微镜昂贵的价格，限制了其在基层的应用。

1.1.3 LED显微镜 将显微镜与发光二极管相结合研发的LED显微镜，具有低价格，长寿命，强可靠性等优点，诊断性能优于标准荧光显微镜。多项研究显示：LED检查的敏感性比传统镜检方法高约10%[6]。同时具备荧光染色的优点，且花费低、可实施性强，可更广泛地常规使用。

1.2 分枝杆菌培养技术

1.2.1 传统结核菌培养 结核菌培养仍是目前诊断MTB的金标准，尤其是药敏试验结果在指导临床用药及耐药性检测等方面具有重要作用[7]，是鉴定是否为活菌的可靠方法，但传统的罗氏培养需要4～6周才能检测到结核菌的生长，而且阳性率也只有30%～40%；特异性差，各种分枝杆菌均可生长，要确定是否为结核菌，需结合分枝杆菌菌种鉴定和药物敏感性试验。

1.2.2 结核菌快速检测系统 BD公司推出的BACTEC-MGIT 960全自动分枝杆菌培养/鉴定/药敏系统，操作简便，阳性标本检出时间平均为9d；鉴定、药敏试验时间平均为4d；阳性标本检出率比传统培养方法提高10.77%，比BACTEC-460法提高4.97%。

1.2.3 液体变色培养基测定法 此方法具有培养和药物敏感性检测的双重功能。其原理是应用含有氧化还原显示剂无色四氮唑盐的液体培养基进行培养，当有分枝杆菌生长时，氧化还原系统将培养基中的无色四氮唑盐还原成不溶于水的紫红色物质，并以颗粒形式分泌至细胞表面，从而使结核分枝杆菌菌落变成肉眼可观察到的红色或紫色菌落。本法阳性结果报告时间平均为10d左右，与LJ培养基比较提高阳性率约为10%～15%，且操作简便，不需要昂贵大型仪器设备，适于在发展中国家和贫困地区推广应用[8]。存在的问题是阳性率不高，结果判断易带主观性，且变色存留时间较短，仅2～3d紫色即消失，需及时观察结果[9]。

1.2.4 噬菌体裂解试验 检测原理是分枝杆菌噬菌体可进入活的分枝杆菌使其感染，随后加入杀毒剂灭活未进入感染菌体内的噬菌体。进入菌体内的噬菌体在感染菌体内大量增殖，并裂解菌体，释放出的子代噬菌体可感染并裂解随后加入的指示细胞，从而在琼脂平板上出现透亮的噬菌斑。因此，只要根据噬菌斑的有无及其多少就可判断待检标本中是否存在活的MTB。由于噬菌体及敏感细胞均能快速增殖，本法从标本采集处理到结果判定只需18～24h，并具有较高的敏感性和特异性，诊断肺结核的总敏感度75.0%，特异度为95.2%，阳性检出率为75.0%，该方法敏感性高、特异性强、操作简便，对结核病临床诊断有较高的应用价值[10]。但其测定结果可受许多测定因素的影响，如噬菌体浓度、结核分枝杆菌活性的保持、指示细胞的配置以及杀毒剂灭活时间等[11]。

2 免疫学检测技术

2.1 结核菌素试验 包括旧结核菌素 (old tuber culin，OT)试验和结核菌素纯蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)试验。优点是快速、简便、低成本，但假阳性率高，标准化难，且难以与卡介苗接种引起的免疫反应相鉴别。

2.2 血清学检测技术 从20世纪70年代建立了酶联免疫吸附法后，形成了很多以检测结核抗体或结核抗原为主的免疫血清学检测方法，在现代结核病的快速诊断中发挥着重要作用。

2.2.1 酶联免疫吸附试验(ELISA)

2.2.1.1 结核抗体测定 主要应用ELISA方法检测结核病人血清中的特异性抗体。然而结核病患者经常因免疫应答低下，导致体液免疫检测或细胞免疫检测假阴性。且由于种属间共同抗原决定簇的存在，导致结核抗原检测的特异性和敏感性低下，致使此法难以取得实质性的进展。

2.2.1.2 结核抗原测定 检测结核病患者血清结核杆菌抗原可以作为结核杆菌存在的直接证据,也可以避免结核病患者因免疫应答低下导致的假阴性结果。近年来由于单克隆抗体制备技术的提高，可以制备高效价的特异性抗体，从而使得检测结核病患者血清中的结核杆菌抗原成为结核诊断的新方法。张周云等[12]利用基因工程方法在体外表达结核分枝杆菌的 desA蛋白抗原制备成单克隆抗体，利用该抗体采用ELISA双抗体夹心法检测了139例临床已确诊的活动性肺结核患者血清中结核抗原，结果表明，其敏感性为 84.17%特异性为92.19%。

2.2.2 酶联免疫斑点(ELI Spot)技术是检测结核抗原致敏的特异性效应T淋巴细胞。本法可区分结核感染者和接种BCG的健康人群。优点是灵敏、特异、快速，12h获得结果，有利于结核感染者和活动性结核病人的早期诊断，将成为基础和临床实验研究的标准技术[13]。缺点是操作较复杂，需特殊仪器设备，试剂费用较贵。

2.2.3 斑点免疫金渗滤试验 (DIGFA)该法比ELISA更为简便、快速，全程只需3～5min，并可单人份测定，由于操作简单，检测迅速，检出率高，不需要贵重仪器设备，能快速测定抗结核抗体，是一种较为理想的临床结核病辅助诊断方法[14]，因此深受欢迎。

2.2.4 免疫印迹技术(Western blot)结核抗体免疫印迹法检测试剂盒选取的抗原来自于结核分枝杆菌全菌，并筛选出最具免疫原性及特异性高的蛋白成份做为诊断抗原，具有很高的敏感性和特异性，用于检测痰菌阳性结核患者、痰菌阴性结核患者、肺外结核病的敏感性分别为93%、86%、89%，特异性超过95%。由于大幅度提高了诊断准确性，可做为结核病诊断的确证实验。但该法较上述几种测定方法繁琐，临床常规检测应用相对较少，主要广泛用于科研实验。

2.3 细胞因子检测 结核分枝杆菌感染人体后，刺激免疫细胞产生保护性细胞因子，其中最主要的是T细胞亚群、IFN-γ、IL-2及SIL-2R。通过检测细胞因子水平可对结核分枝杆菌感染及结核病的诊断提供参考。目前这项技术应用也极为广泛[15-17]。

3 分子生物学检测技术

近年来核酸扩增技术和杂交分析技术的发展，为分枝杆菌的检测、鉴定和药敏实验提供了极大的方便，可将诊断时间从几周降低到几天。研究、应用报道较多的结核病基因诊断技术主要包括聚合酶链反应(PCR)、核酸探针杂交、DNA 序列测定、基因芯片、基因分型等。

3.1 核酸检测技术聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)、核酸探针技术(DNA probe) 、DNA指纹技术等分子生物学技术的特点是检测敏感性高、特异性强、简便、快速，在灵敏性上显著优于培养法和涂片法等传统方法，可以反映结核菌的真实感染情况，对于临床诊断和疗效考察有一定的指导意义[18]。但因需要专门的仪器设备和复杂的技术支撑，在应用范围上受到了极大限制[19-21]。

3.2 基因芯片技术 基因芯片始创于90年代初，又称DNA芯片，是分子生物学前沿的高新技术。其原理是在支持物(玻璃、硅片等)上将探针分子固定，然后与待检标本进行分子杂交，通过检测杂交信号强度从而得出样品分子的数量和序列信息。此方法可一次性对样品大量序列进行检测和分析，具有自动化程度高，操作序列数量多，检测效率高等优点，可用于MTB菌种的鉴定、耐药性的监测、基因组比较分析等方面的研究。黄明翔等[22]应用DNA芯片技术对分枝杆菌阳性培养物进行菌种鉴定，并以传统分枝杆菌菌种鉴定方法为对照，结果两种方法鉴定吻合率为83.6%(112/134)，提示DNA芯片检测技术可以简便、快速、灵敏、特异地进行分枝杆菌的鉴定，但有待进一步完善。

3.3 蛋白芯片技术 此技术是一高特异性、高通量、高灵敏度且微型化的蛋白质分析技术，是蛋白组学研究近年来新兴起的一种方法。其原理是以微孔滤膜作为载体，将纯化的结核菌脂阿拉伯甘露糖(LAM)、蛋白相对分子质量16×103(rTPA16)和38×103(rTPA38)等3种抗原利用微阵列技术固相于同一膜片上，并利用微孔滤膜的渗滤、浓缩凝集作用，在固相膜上快速进行抗原-抗体反应，最后在膜上以免疫金作为标记物直接显色。显色后将芯片放入芯片阅读仪，用专门软件对不同抗原点阵的灰度值进行分析，整个过程不超过30 min。本法诊断结核病的特异性96.3%，灵敏度为72.0%[23]。其与酶联免疫吸附法(ELISA)相比，特异性高、敏感性相当。且金标记物比酶稳定，冻干后可在室温下保存，优于ELISA法。因此，可用于结核病的快速诊断，特别是肺外结核及菌阴肺结核病的快速诊断，该技术为临床诊断结核病起到了积极的作用[24]。

综上所述，由于痰涂片阳性率较低，镜检需要经验，难以区分环境分枝杆菌造成的假阳性；痰培养需时太长，滞后于临床诊断和治疗，因此细菌学检查对结核病的诊断价值有限。血清免疫学检测目前主要做结核抗体检测，由于结核杆菌的抗原性和特异性差，结果也往往不太理想。随着分子生物学技术的迅速发展，用高度敏感的方法检测结核菌及其特异性DNA片段，如PCR、生物探针和基因芯片等，需要相应的检测设备和检测费用高等未能广泛推广。因此，临床实验室必须从菌体水平到分子水平，传统实验方法到现代实验方法，进行全方位的研究和探索，才能适应结核病临床诊断和治疗的需要，为结核病的有效控制提供理想的检测手段。

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